Celspecifieke gepaarde ondervraging van het ovarium-epigenoom en transcriptoom van de muis
Summary
In dit protocol werden de translating ribosome affinity purification (TRAP) methode en de isolatie van nuclei tagged in specific cell types (INTACT) methode geoptimaliseerd voor de gepaarde ondervraging van het celspecifieke ovariumtranscriptoom en epigenoom met behulp van het NuTRAP muismodel gekruist naar een Cyp17a1-Cre muislijn.
Abstract
Het beoordelen van celtype-specifieke epigenomische en transcriptomische veranderingen zijn de sleutel tot het begrijpen van ovariële veroudering. Hiertoe werd de optimalisatie van de translating ribosome affinity purification (TRAP) methode en de isolatie van nuclei tagged in specific cell types (INTACT) methode uitgevoerd voor de daaropvolgende gepaarde ondervraging van het celspecifieke ovariumtranscriptoom en epigenoom met behulp van een nieuw transgeen NuTRAP muismodel. De expressie van het NuTRAP-allel staat onder controle van een gefloxte STOP-cassette en kan worden gericht op specifieke ovariumceltypen met behulp van promotorspecifieke Cre-lijnen. Aangezien recente studies eierstokstromale cellen hebben betrokken bij het aansturen van vroegtijdige verouderingsfenotypen, was het NuTRAP-expressiesysteem gericht op stromale cellen met behulp van een Cyp17a1-Cre-driver. De inductie van het NuTRAP-construct was specifiek voor ovariële stromale fibroblasten en voldoende DNA en RNA voor sequencingstudies werden verkregen uit een enkele eierstok. Het NuTRAP-model en de hier gepresenteerde methoden kunnen worden gebruikt om elk eierstokceltype met een beschikbare Cre-lijn te bestuderen.
Introduction
De eierstokken zijn belangrijke spelers in somatische veroudering1, met verschillende bijdragen van specifieke celpopulaties. De cellulaire heterogeniteit van de eierstok maakt het moeilijk om moleculaire resultaten van bulk, hele eierstoktesten te interpreteren. Het begrijpen van de rol van specifieke celpopulaties bij ovariële veroudering is de sleutel tot het identificeren van de moleculaire factoren die verantwoordelijk zijn voor vruchtbaarheid en gezondheidsafname bij oudere vrouwen. Traditioneel werd de multi-omics beoordeling van specifieke eierstokceltypen bereikt door technieken zoals lasermicrodissectie2, eencellige benaderingen3 of celsortering4. Microdissectie kan echter duur en moeilijk uit te voeren zijn, en celsortering kan cellulaire fenotypische profielen veranderen5.
Een nieuwe benadering om ovariumceltype-specifieke epigenomische en transcriptomische profielen te beoordelen, maakt gebruik van het nucleaire tagging en translating ribosoom affiniteitszuivering (NuTRAP) muismodel. Het NuTRAP-model maakt de isolatie van celtypespecifieke nucleïnezuren mogelijk zonder de noodzaak van celsortering met behulp van de affiniteitszuiveringsmethoden: het vertalen van ribosoomaffiniteitszuivering (TRAP) en isolatie van kernen gelabeld in specifieke celtypen (INTACT)6. De expressie van het NuTRAP-allel staat onder controle van een gefloxte STOP-cassette en kan worden gericht op specifieke ovariumceltypen met behulp van promotorspecifieke Cre-lijnen. Door de NuTRAP-muis te kruisen met een celtypespecifieke Cre-lijn, veroorzaakt het verwijderen van de STOP-cassette eGFP-tagging van het ribosomale complex en biotine / mCherry-tagging van de kern op een Cre-afhankelijke manier6. De TRAP- en INTACT-technieken kunnen vervolgens worden gebruikt om mRNA en nucleair DNA te isoleren van het celtype van belang en over te gaan tot transcriptomische en epigenomische analyses.
Het NuTRAP-model is gebruikt in verschillende weefsels, zoals vetweefsel6, hersenweefsel 7,8,9 en het netvlies 10, om celtypespecifieke epigenomische en transcriptomische veranderingen te onthullen die mogelijk niet worden gedetecteerd in homogenaat van het hele weefsel. De voordelen van de NuTRAP-aanpak ten opzichte van traditionele celsorteertechnieken omvatten het volgende: 1) de preventie van ex vivo activeringsartefacten8, 2) de minimale behoefte aan gespecialiseerde apparatuur (d.w.z. celsorteerders) en 3) de verhoogde doorvoer en lagere kosten van celtypespecifieke analyses. Bovendien maakt de mogelijkheid om celtypespecifiek DNA en RNA van een enkele muis te isoleren gepaarde analyses mogelijk die de statistische kracht vergroten. Aangezien recente studies eierstokstromale cellen hebben betrokken bij het aansturen van vroegtijdige verouderingsfenotypen11,12,13, hebben we het NuTRAP-expressiesysteem gericht op stromale en theca-cellen met behulp van een Cyp17a1-Cre-driver. Hier tonen we aan dat de inductie van het NuTRAP-construct specifiek is voor ovariële stromale en theca-cellen, en dat voldoende DNA en RNA voor sequencingstudies worden verkregen uit een enkele eierstok. Het NuTRAP-model en de hier gepresenteerde methoden kunnen worden gebruikt om elk type eierstokcel te bestuderen met elke beschikbare Cre-lijn.
Voor het genereren van een celtype-specifieke ovariële NuTRAP-muislijn heeft het nucleaire tagging en translating ribosome affinity purification (NuTRAP) allel een floxed STOP-codon dat de expressie van BirA, biotine ligase recognition peptide (BLRP)-gelabeld mCherry / mRANGAP1 en eGFP / L10a regelt. Wanneer gekruist met een celtype-specifieke Cre-lijn, labelt de expressie van de NuTRAP-cassette het nucleaire eiwit mRANGAP1 met biotine / mCherry en ribosomaal eiwit L10a met eGFP op een Cre-afhankelijke manier. Dit maakt het mogelijk om kernen en mRNA van specifieke celtypen te isoleren zonder dat celsortering nodig is. De NuTRAP flox/flox kan worden gecombineerd met een celtype-specifieke Cre die relevant is voor eierstokceltypen om dit te beoordelen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Het NuTRAP-muismodel6 is een krachtige transgene etiketteringsbenadering voor de gepaarde ondervraging van het transcriptoom en het epigenoom van specifieke celtypen die kunnen worden aangepast aan elk celtype met een beschikbare Cre-driver. Hier demonstreren we de specificiteit van het Cyp17-NuTRAP-muismodel bij het richten op ovariële theca- en stromale cellen. Het Cyp17-NuTRAP-model kan worden gebruikt om de theca- en stromale celspecifieke epigenetische mechanismen die betrokken zijn bij eier…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit werk werd ondersteund door subsidies van de National Institutes of Health (NIH) (R01AG070035, R01AG069742, T32AG052363), BrightFocus Foundation (M2020207) en Presbyterian Health Foundation. Dit werk werd ook gedeeltelijk ondersteund door de MERIT award I01BX003906 en een Shared Equipment Evaluation Program (ShEEP) award ISIBX004797 uit de Verenigde Staten (VS) Afdeling Veteranenzaken, Biomedische Laboratorium Onderzoeks- en Ontwikkelingsdienst. De auteurs willen ook het Clinical Genomics Center (OMRF) en Imaging Core Facility (OMRF) bedanken voor hun hulp en instrumentgebruik.
Materials
| 0.1 M Spermidine | Sigma-Aldrich | 05292-1ML-F | |
| 1 M MgCl2 | Thermo Scientific | AM9530G | |
| 10% NP-40 | Thermo Scientific | 85124 | |
| 100 mg/mL Cycloheximide | Sigma-Aldrich | C4859-1ML | |
| 2-mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | M3148 | |
| 30 µm cell strainer | Miltenyi Biotec | 130-098-458 | |
| All Prep DNA/RNA Mini Kit | Qiagen | 80204 | |
| anti-GFP antibody | Abcam | Ab290 | For TRAP and IHC (Rabbit polyclonal to GFP) |
| Buffer RLT | Qiagen | 79216 | RNA Lysis Buffer in protocol |
| cOmplete, mini, EDTA-free protease inhibitor tablet | Roche | 11836170001 | For TRAP Homogenization Buffer |
| Cyp17iCre mouse model | The Jackson Laboratory | 28547 | B6;SJL-Tg(Cyp17a1-icre)AJako/J |
| DynaMag-2 magnet | Invitrogen | 12321D | |
| Genotyping Primers | IDT | Custom | Generic Cre – Jackson Laboratory protocol 22392, Primers: oIMR1084, oIMR1085, oIMR7338, oIMR7339 |
| Cyp17iCre – Jackson Laboratory protocol 30847, Primers: 21218, 31704, 31705, 35663 | |||
| NuTRAP – Jackson Laboratory protocol 21509, Primers: 21306, 24493, 32625, 32626 | |||
| Halt Protease Inhibitor cocktail (100X) | Thermo Scientific | 1861278 | For NPB Buffer |
| M-280 Streptavidin Dynabeads | Invitrogen | 11205D | 2.8 µm bead diameter |
| MixMate | Eppendorf | 5353000529 | |
| Nuclei Isolation Kit: Nuclei EZ Prep | Sigma-Aldrich | Nuc101 | Contains Nuclei Lysis Buffer and Nuclei Storage Buffer |
| 1 M HEPES | Gibco | 15630-080 | |
| 5 M NaCl | Thermo Scientific | AM9760G | |
| 2M KCl | Thermo Scientific | AM9640G | |
| 0.5 M EDTA | Thermo Scientific | AM9260G | |
| 0.5 M EGTA | Fisher Scientific | 50-255-956 | |
| NuTRAP mouse model | The Jackson Laboratory | 29899 | B6;129S6-Gt(ROSA)26Sortm2(CAG-NuTRAP)Evdr/J |
| Pierce DTT No-Weigh Format | Thermo Scientific | A39255 | |
| Protein G Dynabeads | ThermoFisher | 10004D | For TRAP |
| RNaseOUT | Invitrogen | 10777019 | |
| Sodium Heparin | Fisher Scientific | BP2425 | |
| Ultrapure 1M Tris-HCl, pH 7.5 | Invitrogen | 15567-027 | |
| VWR Tube Rotator | Fisher Scientific | NC9854190 |
References
- Broekmans, F. J., Soules, M. R., Fauser, B. C. Ovarian aging: Mechanisms and clinical consequences. Endocrine Reviews. 30 (5), 465-493 (2009).
- Cheng, L., et al. Laser-assisted microdissection in translational research: Theory, technical considerations, and future applications. Applied Immunohistochemistry & Molecular Morphology. 21 (1), 31-47 (2013).
- Morris, M. E., et al. A single-cell atlas of the cycling murine ovary. eLife. 11, 77239 (2022).
- Kendrick, H., et al. Transcriptome analysis of mammary epithelial subpopulations identifies novel determinants of lineage commitment and cell fate. BMC Genomics. 9, 591 (2008).
- Richardson, G. M., Lannigan, J., Macara, I. G. Does FACS perturb gene expression. Cytometry A. 87 (2), 166-175 (2015).
- Roh, H. C., et al. Simultaneous transcriptional and epigenomic profiling from specific cell types within heterogeneous tissues in vivo. Cell Reports. 18 (4), 1048-1061 (2017).
- Chucair-Elliott, A. J., et al. Inducible cell-specific mouse models for paired epigenetic and transcriptomic studies of microglia and astroglia. Communications Biology. 3 (1), 693 (2020).
- Ocanas, S. R., et al. Minimizing the ex vivo confounds of cell-isolation techniques on transcriptomic and translatomic profiles of purified microglia. eNeuro. 9 (2), (2022).
- Raus, A. M., Nelson, N. E., Fuller, T. D., Ivy, A. S. 34;SIT" with Emx1-NuTRAP mice: Simultaneous INTACT and TRAP for paired transcriptomic and epigenetic sequencing. Current Protocols. 2 (10), 570 (2022).
- Chucair-Elliott, A. J., et al. Translatomic response of retinal Muller glia to acute and chronic stress. Neurobiology Disease. 175, 105931 (2022).
- Amargant, F., et al. Ovarian stiffness increases with age in the mammalian ovary and depends on collagen and hyaluronan matrices. Aging Cell. 19 (11), 13259 (2020).
- Briley, S. M., et al. Reproductive age-associated fibrosis in the stroma of the mammalian ovary. Reproduction. 152 (3), 245-260 (2016).
- Umehara, T., et al. Female reproductive life span is extended by targeted removal of fibrotic collagen from the mouse ovary. Science Advances. 8 (24), (2022).
- Lopez-Sanchez, N., Frade, J. M. Cell cycle analysis in the vertebrate brain using immunolabeled fresh cell nuclei. Bio-Protocol. 3 (22), 973 (2013).
- Saccon, T. D., et al. Primordial follicle reserve, DNA damage and macrophage infiltration in the ovaries of the long-living Ames dwarf mice. Experimental Gerontology. 132, 110851 (2020).
- Kinnear, H. M., et al. The ovarian stroma as a new frontier. Reproduction. 160 (3), 25-39 (2020).
- Ajayi, A. F., Akhigbe, R. E. Staging of the estrous cycle and induction of estrus in experimental rodents: an update. Fertility Research and Practice. 6, 5 (2020).
- Tighe, R. M., et al. Improving the quality and reproducibility of flow cytometry in the lung. An official American Thoracic Society workshop report. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 61 (2), 150-161 (2019).
- Zhang, X., et al. Comparative analysis of droplet-based ultra-high-throughput single-cell RNA-Seq systems. Molecular Cell. 73 (1), 130-142 (2019).
- Zheng, G. X., et al. Massively parallel digital transcriptional profiling of single cells. Nature Communications. 8, 14049 (2017).
- Klein, A. M., et al. Droplet barcoding for single-cell transcriptomics applied to embryonic stem cells. Cell. 161 (5), 1187-1201 (2015).
- Macosko, E. Z., et al. Highly parallel genome-wide expression profiling of individual cells using nanoliter droplets. Cell. 161 (5), 1202-1214 (2015).
- Prakadan, S. M., Shalek, A. K., Weitz, D. A. Scaling by shrinking: Empowering single-cell ‘omics’ with microfluidic devices. Nature Reviews Genetics. 18 (6), 345-361 (2017).
- Wang, Q., et al. CoBATCH for high-throughput single-cell epigenomic profiling. Molecular Cell. 76 (1), 206-216 (2019).
- Luo, C., et al. Robust single-cell DNA methylome profiling with snmC-seq2. Nature Communications. 9, 3824 (2018).
- Liu, H., et al. DNA methylation atlas of the mouse brain at single-cell resolution. Nature. 598 (7879), 120-128 (2021).
- Yamawaki, T. M., et al. Systematic comparison of high-throughput single-cell RNA-seq methods for immune cell profiling. BMC Genomics. 22 (1), 66 (2021).
- Hashimshony, T., et al. CEL-Seq2: Sensitive highly-multiplexed single-cell RNA-Seq. Genome Biology. 17, 77 (2016).
- Natarajan, K. N. Single-cell tagged reverse transcription (STRT-Seq). Methods in Molecular Biology. 1979, 133-153 (2019).
- Jaitin, D. A., et al. Massively parallel single-cell RNA-seq for marker-free decomposition of tissues into cell types. Science. 343 (6172), 776-779 (2014).
- Aldridge, S., Teichmann, S. A. Single cell transcriptomics comes of age. Nature Communications. 11, 4307 (2020).
- Clark, S. J., Lee, H. J., Smallwood, S. A., Kelsey, G., Reik, W. Single-cell epigenomics: Powerful new methods for understanding gene regulation and cell identity. Genome Biology. 17, 72 (2016).
- Christensson, E., Lewan, L. The use of spermidine for the isolation of nuclei from mouse liver. Studies of purity and yield during different physiological conditions. Zeitschrift für Naturforschung. Section C, Biosciences. 29 (5-6), 267-271 (1974).
- Levine, M. E., et al. Menopause accelerates biological aging. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (33), 9327-9332 (2016).
- Ossewaarde, M. E., et al. Age at menopause, cause-specific mortality and total life expectancy. Epidemiology. 16 (4), 556-562 (2005).
- Wellons, M., Ouyang, P., Schreiner, P. J., Herrington, D. M., Vaidya, D. Early menopause predicts future coronary heart disease and stroke: the Multi-Ethnic Study of Atherosclerosis. Menopause. 19 (10), 1081-1087 (2012).
- Camaioni, A., et al. The process of ovarian aging: It is not just about oocytes and granulosa cells. Journal of Assisted Reproduction and Genetics. 39 (4), 783-792 (2022).
