Bu protokolde, çevirici ribozom afinite saflaştırma (TRAP) yöntemi ve spesifik hücre tiplerinde etiketlenmiş çekirdeklerin izolasyonu (INTACT) yöntemi, bir Cyp17a1-Cre fare hattına geçilen NuTRAP fare modeli kullanılarak hücreye özgü yumurtalık transkriptomunun ve epigenomun eşleştirilmiş sorgulaması için optimize edilmiştir.
Hücre tipine özgü epigenomik ve transkriptomik değişikliklerin değerlendirilmesi, yumurtalık yaşlanmasını anlamanın anahtarıdır. Bu amaçla, çeviri ribozom afinite saflaştırma (TRAP) yönteminin optimizasyonu ve spesifik hücre tiplerinde etiketlenmiş çekirdeklerin izolasyonu (INTACT) yöntemi, yeni bir transgenik NuTRAP fare modeli kullanılarak hücreye özgü yumurtalık transkriptomu ve epigenomunun daha sonra eşleştirilmiş sorgulaması için gerçekleştirilmiştir. NuTRAP alelinin ekspresyonu, flokslu bir STOP kasetinin kontrolü altındadır ve promotöre özgü Cre hatları kullanılarak spesifik yumurtalık hücre tiplerine hedeflenebilir. Son çalışmalar, erken yaşlanma fenotiplerinin sürülmesinde yumurtalık stromal hücrelerini içerdiğinden, NuTRAP ekspresyon sistemi bir Cyp17a1-Cre sürücüsü kullanılarak stromal hücrelere hedeflenmiştir. NuTRAP yapısının indüksiyonu yumurtalık stromal fibroblastlarına özgüydü ve dizileme çalışmaları için yeterli DNA ve RNA tek bir yumurtalıktan elde edildi. Burada sunulan NuTRAP modeli ve yöntemleri, mevcut bir Cre çizgisine sahip herhangi bir yumurtalık hücre tipini incelemek için kullanılabilir.
Yumurtalıklar, spesifik hücre popülasyonlarından farklı katkılarla somatik yaşlanma1’de önemli oyunculardır. Yumurtalığın hücresel heterojenliği, toplu, tüm yumurtalık tahlillerinden moleküler sonuçların yorumlanmasını zorlaştırır. Yumurtalık yaşlanmasında spesifik hücre popülasyonlarının rolünü anlamak, yaşlı kadınlarda doğurganlık ve sağlık düşüşünden sorumlu moleküler sürücüleri tanımlamanın anahtarıdır. Geleneksel olarak, spesifik over hücre tiplerinin multi-omik değerlendirmesi, lazer mikrodiseksiyon2, tek hücreli yaklaşımlar3 veya hücre sıralama4 gibi tekniklerle elde edilmiştir. Bununla birlikte, mikrodiseksiyonun gerçekleştirilmesi pahalı ve zor olabilir ve hücre sıralaması hücresel fenotipik profilleri değiştirebilir5.
Yumurtalık hücre tipine özgü epigenomik ve transkriptomik profilleri değerlendirmek için yeni bir yaklaşım, nükleer etiketleme ve çeviri ribozom afinite saflaştırma (NuTRAP) fare modelini kullanır. NuTRAP modeli, afinite saflaştırma yöntemlerini kullanarak hücre sıralamasına gerek kalmadan hücre tipine özgü nükleik asitlerin izolasyonuna izin verir: ribozom afinite saflaştırmasının (TRAP) çevrilmesi ve belirli hücre tiplerinde etiketlenmiş çekirdeklerin izolasyonu (INTACT)6. NuTRAP alelinin ekspresyonu, flokslu bir STOP kasetinin kontrolü altındadır ve promotöre özgü Cre hatları kullanılarak spesifik yumurtalık hücre tiplerine hedeflenebilir. NuTRAP fareyi hücre tipine özgü bir Cre çizgisiyle geçerek, STOP kasetinin çıkarılması, ribozomal kompleksin eGFP etiketlemesine ve çekirdeğin Cre’ye bağımlı bir şekilde biyotin / mCherry etiketlemesine neden olur6. TRAP ve INTACT teknikleri daha sonra mRNA ve nükleer DNA’yı ilgilenilen hücre tipinden izole etmek ve transkriptomik ve epigenomik analizlere devam etmek için kullanılabilir.
NuTRAP modeli, yağ dokusu6, beyin dokusu 7,8,9 ve retina 10 gibi farklı dokularda, tüm doku homojenatında tespit edilemeyen hücre tipine özgü epigenomik ve transkriptomik değişiklikleri ortaya çıkarmak için kullanılmıştır. NuTRAP yaklaşımının geleneksel hücre sıralama tekniklerine göre faydaları şunlardır: 1) ex vivo aktivasyonel artefaktların önlenmesi8, 2) özel ekipmana (yani hücre ayıklayıcılara) olan ihtiyacın en aza indirilmesi ve 3) hücre tipine özgü analizlerin artan verimi ve azalan maliyeti. Ek olarak, hücre tipine özgü DNA ve RNA’yı tek bir fareden izole etme yeteneği, istatistiksel gücü artıran eşleştirilmiş analizlere izin verir. Son çalışmalar, erken yaşlanma fenotipleri 11,12,13’ün sürülmesinde yumurtalık stromal hücrelerini içerdiğinden, NuTRAP ekspresyon sistemini bir Cyp17a1-Cre sürücüsü kullanarak stromal ve teka hücrelerine hedefledik. Burada, NuTRAP yapısının indüksiyonunun yumurtalık stromal ve teka hücrelerine özgü olduğunu ve dizileme çalışmaları için yeterli DNA ve RNA’nın tek bir yumurtalıktan elde edildiğini gösteriyoruz. Burada sunulan NuTRAP modeli ve yöntemleri, mevcut herhangi bir Cre çizgisine sahip herhangi bir yumurtalık hücre tipini incelemek için kullanılabilir.
Hücre tipine özgü yumurtalık NuTRAP fare hattının oluşturulması için, nükleer etiketleme ve çevirme ribozom afinite saflaştırma (NuTRAP) aleli, BirA, biyotin ligaz tanıma peptidi (BLRP) etiketli mCherry / mRANGAP1 ve eGFP / L10a’nın ekspresyonunu kontrol eden flokslu bir STOP kodonuna sahiptir. Hücre tipine özgü bir Cre çizgisi ile çaprazlandığında, NuTRAP kasetinin ifadesi, nükleer protein mRANGAP1’i biotin / mCherry ile ve ribozomal protein L10a’yı eGFP ile Cre’ye bağımlı bir şekilde etiketler. Bu, hücre sıralamaya gerek kalmadan çekirdeklerin ve mRNA’nın spesifik hücre tiplerinden izole edilmesine izin verir. NuTRAP floks/ floks , bunu değerlendirmek için yumurtalık hücre tipleriyle ilgili hücre tipine özgü bir Cre ile eşleştirilebilir.
NuTRAP fare modeli6, mevcut bir Cre sürücüsü ile herhangi bir hücre tipine uyarlanabilen belirli hücre tiplerinden transkriptom ve epigenomun eşleştirilmiş sorgulaması için güçlü bir transgenik etiketleme yaklaşımıdır. Burada, Cyp17-NuTRAP fare modelinin yumurtalık teka ve stromal hücreleri hedeflemedeki özgüllüğünü gösteriyoruz. Cyp17-NuTRAP modeli, yumurtalık yaşlanması, kanser ve hastalıkta rol oynayan teka ve stromal hücreye özgü epigenetik mekanizmaları daha…
The authors have nothing to disclose.
Bu çalışma, Ulusal Sağlık Enstitüleri (NIH) (R01AG070035, R01AG069742, T32AG052363), BrightFocus Vakfı (M2020207) ve Presbiteryen Sağlık Vakfı’ndan gelen hibelerle desteklenmiştir. Bu çalışma kısmen MERIT ödülü I01BX003906 ve Amerika Birleşik Devletleri’nden (ABD) Paylaşılan Ekipman Değerlendirme Programı (ShEEP) ödülü ISIBX004797 tarafından da desteklenmiştir. Gazi İşleri Daire Başkanlığı, Biyomedikal Laboratuvarı Araştırma ve Geliştirme Servisi. Yazarlar ayrıca yardım ve cihaz kullanımı için Klinik Genomik Merkezi (OMRF) ve Görüntüleme Çekirdeği Tesisi’ne (OMRF) teşekkür eder.
0.1 M Spermidine | Sigma-Aldrich | 05292-1ML-F | |
1 M MgCl2 | Thermo Scientific | AM9530G | |
10% NP-40 | Thermo Scientific | 85124 | |
100 mg/mL Cycloheximide | Sigma-Aldrich | C4859-1ML | |
2-mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | M3148 | |
30 µm cell strainer | Miltenyi Biotec | 130-098-458 | |
All Prep DNA/RNA Mini Kit | Qiagen | 80204 | |
anti-GFP antibody | Abcam | Ab290 | For TRAP and IHC (Rabbit polyclonal to GFP) |
Buffer RLT | Qiagen | 79216 | RNA Lysis Buffer in protocol |
cOmplete, mini, EDTA-free protease inhibitor tablet | Roche | 11836170001 | For TRAP Homogenization Buffer |
Cyp17iCre mouse model | The Jackson Laboratory | 28547 | B6;SJL-Tg(Cyp17a1-icre)AJako/J |
DynaMag-2 magnet | Invitrogen | 12321D | |
Genotyping Primers | IDT | Custom | Generic Cre – Jackson Laboratory protocol 22392, Primers: oIMR1084, oIMR1085, oIMR7338, oIMR7339 |
Cyp17iCre – Jackson Laboratory protocol 30847, Primers: 21218, 31704, 31705, 35663 | |||
NuTRAP – Jackson Laboratory protocol 21509, Primers: 21306, 24493, 32625, 32626 | |||
Halt Protease Inhibitor cocktail (100X) | Thermo Scientific | 1861278 | For NPB Buffer |
M-280 Streptavidin Dynabeads | Invitrogen | 11205D | 2.8 µm bead diameter |
MixMate | Eppendorf | 5353000529 | |
Nuclei Isolation Kit: Nuclei EZ Prep | Sigma-Aldrich | Nuc101 | Contains Nuclei Lysis Buffer and Nuclei Storage Buffer |
1 M HEPES | Gibco | 15630-080 | |
5 M NaCl | Thermo Scientific | AM9760G | |
2M KCl | Thermo Scientific | AM9640G | |
0.5 M EDTA | Thermo Scientific | AM9260G | |
0.5 M EGTA | Fisher Scientific | 50-255-956 | |
NuTRAP mouse model | The Jackson Laboratory | 29899 | B6;129S6-Gt(ROSA)26Sortm2(CAG-NuTRAP)Evdr/J |
Pierce DTT No-Weigh Format | Thermo Scientific | A39255 | |
Protein G Dynabeads | ThermoFisher | 10004D | For TRAP |
RNaseOUT | Invitrogen | 10777019 | |
Sodium Heparin | Fisher Scientific | BP2425 | |
Ultrapure 1M Tris-HCl, pH 7.5 | Invitrogen | 15567-027 | |
VWR Tube Rotator | Fisher Scientific | NC9854190 |