Interrogação pareada célula-específica do epigenoma e transcriptoma ovariano de camundongos

Summary

Neste protocolo, o método de purificação por afinidade do ribossomo (TRAP) e o isolamento de núcleos marcados em tipos celulares específicos (INTACT) foram otimizados para a interrogação pareada do transcriptoma e epigenoma ovariano célula-específica usando o modelo de camundongo NuTRAP cruzado com uma linhagem de camundongo Cyp17a1-Cre.

Abstract

A avaliação das alterações epigenômicas e transcriptômicas específicas do tipo celular é fundamental para a compreensão do envelhecimento ovariano. Para este fim, a otimização do método de purificação por afinidade do ribossomo (TRAP) e o isolamento de núcleos marcados em tipos celulares específicos (INTACT) foram realizados para a subsequente interrogação pareada do transcriptoma e epigenoma ovariano célula-específica usando um novo modelo transgênico de camundongo NuTRAP. A expressão do alelo NuTRAP está sob o controle de um STOP floxado e pode ser direcionada para tipos específicos de células ovarianas usando linhas Cre promotoras-específicas. Uma vez que estudos recentes implicaram células estromais ovarianas na condução de fenótipos de envelhecimento precoce, o sistema de expressão NuTRAP foi direcionado para células estromais usando um driver Cyp17a1-Cre. A indução da construção NuTRAP foi específica para fibroblastos estromais ovarianos, e DNA e RNA suficientes para estudos de sequenciamento foram obtidos de um único ovário. O modelo e os métodos NuTRAP aqui apresentados podem ser usados para estudar qualquer tipo de célula ovariana com uma linha Cre disponível.

Introduction

Os ovários são os principais atores no envelhecimento somático¹, com contribuições distintas de populações celulares específicas. A heterogeneidade celular do ovário dificulta a interpretação dos resultados moleculares de ensaios volumosos de ovário inteiro. Compreender o papel de populações celulares específicas no envelhecimento ovariano é fundamental para identificar os fatores moleculares responsáveis pelo declínio da fertilidade e da saúde em mulheres idosas. Tradicionalmente, a avaliação multi-ômica de tipos específicos de células ovarianas era realizada por técnicas como microdissecção a laser², abordagens unicelulares³ ou triagem celular⁴. No entanto, a microdissecção pode ser cara e de difícil execução, e a triagem celular pode alterar o perfil fenotípico^celular5.

Uma nova abordagem para avaliar perfis epigenômicos e transcriptômicos específicos de células ovarianas usa o modelo de camundongo de purificação de afinidade de ribossomo nuclear (NuTRAP). O modelo NuTRAP permite o isolamento de ácidos nucléicos específicos do tipo celular sem a necessidade de triagem celular usando os métodos de purificação por afinidade: tradução da purificação por afinidade do ribossomo (TRAP) e isolamento de núcleos marcados em tipos celulares específicos (INTACT)⁶. A expressão do alelo NuTRAP está sob o controle de um STOP floxado e pode ser direcionada para tipos específicos de células ovarianas usando linhas Cre promotoras-específicas. Ao cruzar o camundongo NuTRAP com uma linha Cre específica do tipo celular, a remoção do STOP causa marcação eGFP do complexo ribossomal e marcação biotina/mCherry do núcleo de maneira dependente^{de Cre 6}. As técnicas TRAP e INTACT podem então ser usadas para isolar o RNAm e o DNA nuclear do tipo celular de interesse e proceder a análises transcriptômicas e epigenômicas.

O modelo NuTRAP tem sido utilizado em diferentes tecidos, como tecido adiposo⁶, tecido cerebral ^7,8,9 e retina^10, para revelar alterações epigenômicas e transcriptômicas específicas do tipo celular que podem não ser detectadas no homogeneizado de tecido total. Os benefícios da abordagem NuTRAP sobre as técnicas tradicionais de classificação celular incluem o seguinte: 1) a prevenção de artefatos de ativação ex vivo ⁸, 2) a necessidade minimizada de equipamentos especializados (i.e., classificadores celulares) e 3) o aumento do rendimento e a diminuição do custo das análises específicas do tipo celular. Além disso, a capacidade de isolar DNA e RNA específicos do tipo celular de um único camundongo permite análises pareadas que aumentam o poder estatístico. Uma vez que estudos recentes têm implicado células estromais ovarianas na condução de fenótipos de envelhecimento precoce 11,12,13^, direcionamos o sistema de expressão NuTRAP para células estromais e tecais usando um driver Cyp17a1-Cre. Aqui, demonstramos que a indução da construção NuTRAP é específica para células do estroma ovariano e teca, e DNA e RNA suficientes para estudos de sequenciamento são obtidos de um único ovário. O modelo e os métodos NuTRAP aqui apresentados podem ser usados para estudar qualquer tipo de célula ovariana com qualquer linha Cre disponível.

Para a geração de uma linhagem de camundongos NuTRAP ovarianos específicos do tipo celular, o alelo nuclear de marcação e purificação de afinidade do ribossomo (NuTRAP) tem um códon STOP floxado que controla a expressão de BirA, peptídeo de reconhecimento de biotina ligase (BLRP) marcado com mCherry/mRANGAP1 e eGFP/L10a. Quando cruzada com uma linha Cre específica do tipo celular, a expressão do NuTRAP rotula a proteína nuclear mRANGAP1 com biotina/mCherry e a proteína ribossomal L10a com eGFP de maneira Cre-dependente. Isso permite o isolamento de núcleos e RNAm de tipos celulares específicos sem a necessidade de classificação celular. O^flox/flox NuTRAP pode ser emparelhado com um Cre específico para o tipo de célula relevante para os tipos de células ovarianas para avaliar isso.

Protocol

Todos os procedimentos com animais foram aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais da Oklahoma Medical Research Foundation (OMRF). Camundongos progenitores foram adquiridos no Jackson Laboratory (Bar Harbor, ME) e criados e alojados sob condições de FPS em um ambiente de barreira HEPA em um ciclo claro/escuro de 14 h/10 h (luzes acesas às 6:00 horas) na OMRF. NOTA: Nesta demonstração, usamos um macho Cyp17iCre+/−(Strain # 028547, The Jackson Laboratory…

Representative Results

Um esquema dos protocolos TRAP e INTACT é mostrado na Figura 1. Aqui, a especificidade do modelo de camundongo Cyp17-NuTRAP para células estromais/tecais ovarianas é demonstrada por imagem imunofluorescente e RNA-Seq a partir de RNA isolado por TRAP. Primeiramente, foram realizadas imagens de imunofluorescência do sinal da eGFP no ovário e localização do sinal da eGFP para as células da teca e do estromal. Resumidamente, cortes de 5 μm foram desparafinizados com gradiente de xileno …

Discussion

O modelo de camundongo NuTRAP⁶ é uma poderosa abordagem de marcação transgênica para a interrogação pareada do transcriptoma e epigenoma de tipos celulares específicos que podem ser adaptados a qualquer tipo de célula com um driver Cre disponível. Aqui, demonstramos a especificidade do modelo de camundongo Cyp17-NuTRAP em atingir tecas ovarianas e células estromais. O modelo Cyp17-NuTRAP pode ser usado para elucidar ainda mais os mecanismos epigenéticos específicos da teca e da célula…

Materials

0.1 M Spermidine	Sigma-Aldrich	05292-1ML-F
1 M MgCl2	Thermo Scientific	AM9530G
10% NP-40	Thermo Scientific	85124
100 mg/mL Cycloheximide	Sigma-Aldrich	C4859-1ML
2-mercaptoethanol	Sigma-Aldrich	M3148
30 µm cell strainer	Miltenyi Biotec	130-098-458
All Prep DNA/RNA Mini Kit	Qiagen	80204
anti-GFP antibody	Abcam	Ab290	For TRAP and IHC (Rabbit polyclonal to GFP)
Buffer RLT	Qiagen	79216	RNA Lysis Buffer in protocol
cOmplete, mini, EDTA-free protease inhibitor tablet	Roche	11836170001	For TRAP Homogenization Buffer
Cyp17iCre mouse model	The Jackson Laboratory	28547	B6;SJL-Tg(Cyp17a1-icre)AJako/J
DynaMag-2 magnet	Invitrogen	12321D
Genotyping Primers	IDT	Custom	Generic Cre – Jackson Laboratory protocol 22392, Primers: oIMR1084, oIMR1085, oIMR7338, oIMR7339
			Cyp17iCre – Jackson Laboratory protocol 30847, Primers: 21218, 31704, 31705, 35663
			NuTRAP – Jackson Laboratory protocol 21509, Primers: 21306, 24493, 32625, 32626
Halt Protease Inhibitor cocktail (100X)	Thermo Scientific	1861278	For NPB Buffer
M-280 Streptavidin Dynabeads	Invitrogen	11205D	2.8 µm bead diameter
MixMate	Eppendorf	5353000529
Nuclei Isolation Kit: Nuclei EZ Prep	Sigma-Aldrich	Nuc101	Contains Nuclei Lysis Buffer and Nuclei Storage Buffer
1 M HEPES	Gibco	15630-080
5 M NaCl	Thermo Scientific	AM9760G
2M KCl	Thermo Scientific	AM9640G
0.5 M EDTA	Thermo Scientific	AM9260G
0.5 M EGTA	Fisher Scientific	50-255-956
NuTRAP mouse model	The Jackson Laboratory	29899	B6;129S6-Gt(ROSA)26Sortm2(CAG-NuTRAP)Evdr/J
Pierce DTT No-Weigh Format	Thermo Scientific	A39255
Protein G Dynabeads	ThermoFisher	10004D	For TRAP
RNaseOUT	Invitrogen	10777019
Sodium Heparin	Fisher Scientific	BP2425
Ultrapure 1M Tris-HCl, pH 7.5	Invitrogen	15567-027
VWR Tube Rotator	Fisher Scientific	NC9854190