마우스 난소 후성유전체와 전사체의 세포 특이적 쌍 조사
Summary
이 프로토콜에서 번역 리보솜 친화성 정제(TRAP) 방법과 특정 세포 유형에서 태그된 핵의 분리(INTACT) 방법은 Cyp17a1-Cre 마우스 라인과 교차하는 NuTRAP 마우스 모델을 사용하여 세포 특이적 난소 전사체와 후성유전체의 쌍을 이루는 조사에 최적화되었습니다.
Abstract
세포 유형별 후성유전체학 및 전사체 변화를 평가하는 것은 난소 노화를 이해하는 데 중요합니다. 이를 위해, 새로운 형질전환 NuTRAP 마우스 모델을 사용하여 세포 특이적 난소 전사체 및 후성유전체의 후속 쌍 조사에 대해 번역 리보솜 친화성 정제(TRAP) 방법 및 특정 세포 유형에서 태그된 핵 분리(INTACT) 방법의 최적화를 수행했습니다. NuTRAP 대립유전자의 발현은 플록싱된 STOP 카세트의 제어 하에 있으며 프로모터 특이적 Cre 라인을 사용하여 특정 난소 세포 유형을 표적화할 수 있습니다. 최근 연구에서 난소 기질 세포가 조기 노화 표현형을 유도하는 것과 관련이 있기 때문에 NuTRAP 발현 시스템은 Cyp17a1-Cre 드라이버를 사용하여 기질 세포를 표적으로 삼았습니다. NuTRAP 구조체의 유도는 난소 기질 섬유아세포에 특이적이었고, 시퀀싱 연구를 위한 충분한 DNA 및 RNA가 단일 난소로부터 얻어졌다. 여기에 제시된 NuTRAP 모델 및 방법은 사용 가능한 Cre 라인이 있는 모든 난소 세포 유형을 연구하는 데 사용할 수 있습니다.
Introduction
난소는 체세포 노화의 주요 원인이다1, 특정 세포 집단에서 뚜렷한 기여를 한다. 난소의 세포 이질성은 대량의 전체 난소 분석의 분자 결과를 해석하기 어렵게 만듭니다. 난소 노화에서 특정 세포 집단의 역할을 이해하는 것은 노인 여성의 생식 능력과 건강 감소를 담당하는 분자 동인을 식별하는 데 중요합니다. 전통적으로, 특정 난소 세포 유형에 대한 다중 오믹스 평가는 레이저 미세해부(laser microdissection)2, 단세포 접근법(single-cell approach)3 또는 세포 분류(cell sorting)4와 같은 기법으로 이루어졌다. 그러나 미세 해부는 비용이 많이 들고 수행하기 어려울 수 있으며 세포 분류는 세포 표현형 프로파일을 변경할 수 있습니다5.
난소 세포 유형별 후성유전체학 및 전사체 프로파일을 평가하는 새로운 접근 방식은 핵 태깅 및 번역 리보솜 친화성 정제(NuTRAP) 마우스 모델을 사용합니다. NuTRAP 모델은 친화성 정제 방법인 번역 리보솜 친화성 정제(TRAP) 및 특정 세포 유형에서 태그가 부착된 핵의 분리(INTACT)6를 사용하여 세포 분류할 필요 없이 세포 유형별 핵산을 분리할 수 있습니다. NuTRAP 대립유전자의 발현은 플록싱된 STOP 카세트의 제어 하에 있으며 프로모터 특이적 Cre 라인을 사용하여 특정 난소 세포 유형을 표적화할 수 있습니다. NuTRAP 마우스를 세포 유형별 Cre 라인과 교차시킴으로써, STOP 카세트의 제거는 리보솜 복합체의 eGFP-태깅과 Cre-의존적 방식으로 핵의 비오틴/mCherry-태깅을 유발한다6. 그런 다음 TRAP 및 INTACT 기술을 사용하여 관심 세포 유형에서 mRNA와 핵 DNA를 분리하고 전사체 및 후성유전체 분석을 진행할 수 있습니다.
NuTRAP 모델은 지방 조직6, 뇌 조직7, 8, 9 및 망막10과 같은 다양한 조직에서 사용되어 전체 조직 균질액에서 검출되지 않을 수 있는 세포 유형별 후성유전체 및 전사체 변화를 밝혀냈습니다. 기존 세포 분류 기법에 비해 NuTRAP 접근법의 이점에는 1) 생체 외 활성화 아티팩트방지8, 2) 특수 장비(예: 세포 분류기)의 필요성 최소화, 3) 세포 유형별 분석의 처리량 증가 및 비용 절감이 포함됩니다. 또한 단일 마우스에서 세포 유형별 DNA와 RNA를 분리할 수 있는 기능을 통해 통계적 검정력을 높이는 쌍 분석이 가능합니다. 최근 연구에서 난소 기질 세포가 조기 노화 표현형 11,12,13을 유도하는 것과 관련이 있기 때문에 Cyp17a1-Cre 드라이버를 사용하여 NuTRAP 발현 시스템을 기질 및 테카 세포로 표적화했습니다. 여기에서 우리는 NuTRAP 구조의 유도가 난소 기질 및 테카 세포에 특이적이며 시퀀싱 연구를 위한 충분한 DNA와 RNA가 단일 난소에서 얻어진다는 것을 보여줍니다. 여기에 제시된 NuTRAP 모델 및 방법은 사용 가능한 모든 Cre 라인이 있는 모든 난소 세포 유형을 연구하는 데 사용할 수 있습니다.
세포 유형 특이적 난소 NuTRAP 마우스 라인의 생성을 위해 핵 태깅 및 번역 리보솜 친화성 정제(NuTRAP) 대립유전자는 BirA, 비오틴 리가제 인식 펩타이드(BLRP) 태그가 지정된 mCherry/mRANGAP1 및 eGFP/L10a의 발현을 조절하는 플록싱된 STOP 코돈을 가지고 있습니다. 세포 유형별 Cre 라인과 교차할 때 NuTRAP 카세트의 발현은 핵 단백질 mRANGAP1을 비오틴/mCherry로, 리보솜 단백질 L10a를 eGFP로 Cre 의존적으로 라벨링합니다. 이를 통해 세포 분류 없이 특정 세포 유형에서 핵과 mRNA를 분리할 수 있습니다. NuTRAPflox/flox 는 난소 세포 유형과 관련된 세포 유형별 Cre와 쌍을 이루어 이를 평가할 수 있습니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
NuTRAP 마우스 모델6은 사용 가능한 Cre 드라이버를 사용하여 모든 세포 유형에 적용할 수 있는 특정 세포 유형에서 전사체와 후성유전체를 쌍으로 조사하기 위한 강력한 형질전환 라벨링 접근 방식입니다. 여기에서 우리는 난소 테카 및 기질 세포를 표적으로 하는 Cyp17-NuTRAP 마우스 모델의 특이성을 입증합니다. Cyp17-NuTRAP 모델은 난소 노화, 암 및 질병과 관련된 테카 및 기질 세포 ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 작업은 미국 국립보건원(NIH) (R01AG070035, R01AG069742, T32AG052363), 브라이트포커스 재단(M2020207) 및 장로교 보건 재단의 보조금으로 지원되었다. 이 작업은 또한 미국(미국)의 MERIT 상 I01BX003906 및 공유 장비 평가 프로그램(ShEEP) 상 ISIBX004797에 의해 부분적으로 지원되었습니다. 재향 군인회, 생물 의학 실험실 연구 및 개발 서비스. 저자는 또한 도움과 기기 사용에 대해 임상 유전체학 센터(OMRF)와 이미징 핵심 시설(OMRF)에 감사를 표합니다.
Materials
| 0.1 M Spermidine | Sigma-Aldrich | 05292-1ML-F | |
| 1 M MgCl2 | Thermo Scientific | AM9530G | |
| 10% NP-40 | Thermo Scientific | 85124 | |
| 100 mg/mL Cycloheximide | Sigma-Aldrich | C4859-1ML | |
| 2-mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | M3148 | |
| 30 µm cell strainer | Miltenyi Biotec | 130-098-458 | |
| All Prep DNA/RNA Mini Kit | Qiagen | 80204 | |
| anti-GFP antibody | Abcam | Ab290 | For TRAP and IHC (Rabbit polyclonal to GFP) |
| Buffer RLT | Qiagen | 79216 | RNA Lysis Buffer in protocol |
| cOmplete, mini, EDTA-free protease inhibitor tablet | Roche | 11836170001 | For TRAP Homogenization Buffer |
| Cyp17iCre mouse model | The Jackson Laboratory | 28547 | B6;SJL-Tg(Cyp17a1-icre)AJako/J |
| DynaMag-2 magnet | Invitrogen | 12321D | |
| Genotyping Primers | IDT | Custom | Generic Cre – Jackson Laboratory protocol 22392, Primers: oIMR1084, oIMR1085, oIMR7338, oIMR7339 |
| Cyp17iCre – Jackson Laboratory protocol 30847, Primers: 21218, 31704, 31705, 35663 | |||
| NuTRAP – Jackson Laboratory protocol 21509, Primers: 21306, 24493, 32625, 32626 | |||
| Halt Protease Inhibitor cocktail (100X) | Thermo Scientific | 1861278 | For NPB Buffer |
| M-280 Streptavidin Dynabeads | Invitrogen | 11205D | 2.8 µm bead diameter |
| MixMate | Eppendorf | 5353000529 | |
| Nuclei Isolation Kit: Nuclei EZ Prep | Sigma-Aldrich | Nuc101 | Contains Nuclei Lysis Buffer and Nuclei Storage Buffer |
| 1 M HEPES | Gibco | 15630-080 | |
| 5 M NaCl | Thermo Scientific | AM9760G | |
| 2M KCl | Thermo Scientific | AM9640G | |
| 0.5 M EDTA | Thermo Scientific | AM9260G | |
| 0.5 M EGTA | Fisher Scientific | 50-255-956 | |
| NuTRAP mouse model | The Jackson Laboratory | 29899 | B6;129S6-Gt(ROSA)26Sortm2(CAG-NuTRAP)Evdr/J |
| Pierce DTT No-Weigh Format | Thermo Scientific | A39255 | |
| Protein G Dynabeads | ThermoFisher | 10004D | For TRAP |
| RNaseOUT | Invitrogen | 10777019 | |
| Sodium Heparin | Fisher Scientific | BP2425 | |
| Ultrapure 1M Tris-HCl, pH 7.5 | Invitrogen | 15567-027 | |
| VWR Tube Rotator | Fisher Scientific | NC9854190 |
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