Interrogación pareada específica de células del epigenoma ovárico y transcriptoma de ratón
Summary
En este protocolo, el método de purificación de afinidad ribosómica por traducción (TRAP) y el método de aislamiento de núcleos marcados en tipos celulares específicos (INTACT) se optimizaron para la interrogación pareada del transcriptoma ovárico específico de células y el epigenoma utilizando el modelo de ratón NuTRAP cruzado a una línea de ratón Cyp17a1-Cre.
Abstract
La evaluación de los cambios epigenómicos y transcriptómicos específicos del tipo celular es clave para comprender el envejecimiento ovárico. Con este fin, se realizó la optimización del método de purificación de afinidad ribosómica por traducción (TRAP) y el método de aislamiento de núcleos marcados en tipos celulares específicos (INTACT) para el posterior interrogatorio pareado del transcriptoma ovárico específico de células y el epigenoma utilizando un nuevo modelo de ratón NuTRAP transgénico. La expresión del alelo NuTRAP está bajo el control de un casete STOP floxed y puede dirigirse a tipos específicos de células ováricas utilizando líneas Cre específicas del promotor. Dado que estudios recientes han implicado a las células del estroma ovárico en la conducción de fenotipos de envejecimiento prematuro, el sistema de expresión NuTRAP se dirigió a las células del estroma utilizando un controlador Cyp17a1-Cre. La inducción de la construcción NuTRAP fue específica para los fibroblastos del estroma ovárico, y se obtuvo suficiente ADN y ARN para los estudios de secuenciación de un solo ovario. El modelo NuTRAP y los métodos presentados aquí se pueden utilizar para estudiar cualquier tipo de célula ovárica con una línea Cre disponible.
Introduction
Los ovarios son actores importantes en el envejecimiento somático1, con distintas contribuciones de poblaciones celulares específicas. La heterogeneidad celular del ovario dificulta la interpretación de los resultados moleculares de los ensayos masivos de ovario completo. Comprender el papel de poblaciones celulares específicas en el envejecimiento ovárico es clave para identificar los impulsores moleculares responsables de la fertilidad y el deterioro de la salud en mujeres de edad avanzada. Tradicionalmente, la evaluación multiómica de tipos específicos de células ováricas se lograba mediante técnicas como la microdisección láser2, los enfoques unicelulares3 o la clasificación celular4. Sin embargo, la microdisección puede ser costosa y difícil de realizar, y la clasificación celular puede alterar los perfiles fenotípicos celulares5.
Un enfoque novedoso para evaluar los perfiles epigenómicos y transcriptómicos específicos del tipo de células ováricas utiliza el modelo de ratón de purificación de afinidad de ribosomas de etiquetado nuclear y traducción (NuTRAP). El modelo NuTRAP permite el aislamiento de ácidos nucleicos específicos del tipo celular sin necesidad de clasificación celular mediante el uso de los métodos de purificación de afinidad: purificación de afinidad ribosómica traducida (TRAP) y aislamiento de núcleos marcados en tipos celulares específicos (INTACT)6. La expresión del alelo NuTRAP está bajo el control de un casete STOP floxed y puede dirigirse a tipos específicos de células ováricas utilizando líneas Cre específicas del promotor. Al cruzar el ratón NuTRAP con una línea Cre específica del tipo celular, la eliminación del casete STOP provoca el marcado eGFP del complejo ribosómico y el marcado biotina/mCherry del núcleo de una manera dependiente de Cre6. Las técnicas TRAP e INTACT se pueden utilizar para aislar el ARNm y el ADN nuclear del tipo de célula de interés y proceder a análisis transcriptómicos y epigenómicos.
El modelo NuTRAP se ha utilizado en diferentes tejidos, como el tejido adiposo6, el tejido cerebral 7,8,9 y la retina10, para revelar cambios epigenómicos y transcriptómicos específicos del tipo celular que pueden no detectarse en el homogeneizado de todo el tejido. Los beneficios del enfoque NuTRAP sobre las técnicas tradicionales de clasificación celular incluyen lo siguiente: 1) la prevención de artefactos de activación ex vivo 8, 2) la necesidad minimizada de equipos especializados (es decir, clasificadores celulares) y 3) el aumento del rendimiento y la disminución del costo de los análisis específicos del tipo de célula. Además, la capacidad de aislar ADN y ARN específicos del tipo de célula de un solo ratón permite análisis pareados que aumentan el poder estadístico. Dado que estudios recientes han implicado a las células del estroma ovárico en la conducción de los fenotipos de envejecimiento prematuro 11,12,13, dirigimos el sistema de expresión NuTRAP a las células del estroma y la teca utilizando un controlador Cyp17a1-Cre. Aquí, demostramos que la inducción de la construcción NuTRAP es específica para las células del estroma ovárico y la teca, y se obtiene suficiente ADN y ARN para los estudios de secuenciación de un solo ovario. El modelo NuTRAP y los métodos presentados aquí se pueden utilizar para estudiar cualquier tipo de célula ovárica con cualquier línea Cre disponible.
Para la generación de una línea de ratón NuTRAP ovárico específica para el tipo celular, el alelo de purificación de afinidad de ribosomas de marcado nuclear y traducción (NuTRAP) tiene un codón STOP floxado que controla la expresión de BirA, mCherry/mRANGAP1 marcado con el péptido de reconocimiento de biotina ligasa (BLRP) y eGFP/L10a. Cuando se cruza con una línea Cre específica del tipo celular, la expresión del casete NuTRAP marca la proteína nuclear mRANGAP1 con biotina/mCherry y la proteína ribosómica L10a con eGFP de una manera dependiente de Cre. Esto permite el aislamiento de núcleos y ARNm de tipos celulares específicos sin necesidad de clasificación celular. El NuTRAP flox/flox se puede emparejar con un Cre específico del tipo de célula relevante para los tipos de células ováricas para evaluar esto.
Protocol
Representative Results
Discussion
El modelo de ratón NuTRAP 6 es un poderoso enfoque de etiquetado transgénico para la interrogación pareada del transcriptoma y el epigenoma de tipos de células específicas que se pueden adaptar a cualquier tipode célula con un controlador Cre disponible. Aquí, demostramos la especificidad del modelo de ratón Cyp17-NuTRAP para dirigirse a la teca ovárica y las células del estroma. El modelo Cyp17-NuTRAP se puede utilizar para dilucidar aún más los mecanismos epigenéticos específicos d…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabajo fue apoyado por subvenciones de los Institutos Nacionales de Salud (NIH) (R01AG070035, R01AG069742, T32AG052363), BrightFocus Foundation (M2020207) y Presbyterian Health Foundation. Este trabajo también fue apoyado en parte por el premio MERIT I01BX003906 y un premio del Programa de Evaluación de Equipos Compartidos (ShEEP) ISIBX004797 de los Estados Unidos (EE. Departamento de Asuntos de Veteranos, Servicio de Investigación y Desarrollo de Laboratorios Biomédicos. Los autores también desean agradecer al Centro de Genómica Clínica (OMRF) y al Imaging Core Facility (OMRF) por la asistencia y el uso del instrumento.
Materials
| 0.1 M Spermidine | Sigma-Aldrich | 05292-1ML-F | |
| 1 M MgCl2 | Thermo Scientific | AM9530G | |
| 10% NP-40 | Thermo Scientific | 85124 | |
| 100 mg/mL Cycloheximide | Sigma-Aldrich | C4859-1ML | |
| 2-mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | M3148 | |
| 30 µm cell strainer | Miltenyi Biotec | 130-098-458 | |
| All Prep DNA/RNA Mini Kit | Qiagen | 80204 | |
| anti-GFP antibody | Abcam | Ab290 | For TRAP and IHC (Rabbit polyclonal to GFP) |
| Buffer RLT | Qiagen | 79216 | RNA Lysis Buffer in protocol |
| cOmplete, mini, EDTA-free protease inhibitor tablet | Roche | 11836170001 | For TRAP Homogenization Buffer |
| Cyp17iCre mouse model | The Jackson Laboratory | 28547 | B6;SJL-Tg(Cyp17a1-icre)AJako/J |
| DynaMag-2 magnet | Invitrogen | 12321D | |
| Genotyping Primers | IDT | Custom | Generic Cre – Jackson Laboratory protocol 22392, Primers: oIMR1084, oIMR1085, oIMR7338, oIMR7339 |
| Cyp17iCre – Jackson Laboratory protocol 30847, Primers: 21218, 31704, 31705, 35663 | |||
| NuTRAP – Jackson Laboratory protocol 21509, Primers: 21306, 24493, 32625, 32626 | |||
| Halt Protease Inhibitor cocktail (100X) | Thermo Scientific | 1861278 | For NPB Buffer |
| M-280 Streptavidin Dynabeads | Invitrogen | 11205D | 2.8 µm bead diameter |
| MixMate | Eppendorf | 5353000529 | |
| Nuclei Isolation Kit: Nuclei EZ Prep | Sigma-Aldrich | Nuc101 | Contains Nuclei Lysis Buffer and Nuclei Storage Buffer |
| 1 M HEPES | Gibco | 15630-080 | |
| 5 M NaCl | Thermo Scientific | AM9760G | |
| 2M KCl | Thermo Scientific | AM9640G | |
| 0.5 M EDTA | Thermo Scientific | AM9260G | |
| 0.5 M EGTA | Fisher Scientific | 50-255-956 | |
| NuTRAP mouse model | The Jackson Laboratory | 29899 | B6;129S6-Gt(ROSA)26Sortm2(CAG-NuTRAP)Evdr/J |
| Pierce DTT No-Weigh Format | Thermo Scientific | A39255 | |
| Protein G Dynabeads | ThermoFisher | 10004D | For TRAP |
| RNaseOUT | Invitrogen | 10777019 | |
| Sodium Heparin | Fisher Scientific | BP2425 | |
| Ultrapure 1M Tris-HCl, pH 7.5 | Invitrogen | 15567-027 | |
| VWR Tube Rotator | Fisher Scientific | NC9854190 |
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