Клеточно-специфический парный опрос эпигенома яичников мыши и транскриптома
Summary
В этом протоколе метод трансляционной очистки аффинности рибосом (TRAP) и метод выделения ядер, меченных в определенных типах клеток (INTACT), были оптимизированы для парного опроса клеточно-специфического транскриптома яичников и эпигенома с использованием мышиной модели NuTRAP, скрещенной с линией мыши Cyp17a1-Cre.
Abstract
Оценка эпигеномных и транскриптомных изменений, специфичных для клеточного типа, является ключом к пониманию старения яичников. С этой целью была проведена оптимизация метода трансляционной очистки аффинности рибосом (TRAP) и метода выделения ядер, меченных в определенные типы клеток (INTACT) для последующего парного опроса клеточно-специфического транскриптома яичников и эпигенома с использованием новой трансгенной мышиной модели NuTRAP. Экспрессия аллеля NuTRAP находится под контролем флоксированной кассеты STOP и может быть нацелена на определенные типы клеток яичников с использованием промотор-специфических линий Cre. Поскольку недавние исследования показали, что стромальные клетки яичников управляют фенотипами преждевременного старения, система экспрессии NuTRAP была нацелена на стромальные клетки с использованием драйвера Cyp17a1-Cre. Индукция конструкции NuTRAP была специфична для стромальных фибробластов яичников, и достаточное количество ДНК и РНК для исследований секвенирования было получено из одного яичника. Представленная здесь модель и методы NuTRAP могут быть использованы для изучения любого типа клеток яичников с доступной линией Cre.
Introduction
Яичники являются основными игроками в соматическом старении1, с отчетливым вкладом определенных клеточных популяций. Клеточная гетерогенность яичника затрудняет интерпретацию молекулярных результатов анализов объемных и цельных яичников. Понимание роли специфических клеточных популяций в старении яичников является ключом к выявлению молекулярных факторов, ответственных за снижение фертильности и здоровья у пожилых женщин. Традиционно мультиомическая оценка конкретных типов клеток яичников достигалась с помощью таких методов, как лазерная микродиссекция2, одноклеточные подходы3 или сортировка клеток4. Однако микродиссекция может быть дорогостоящей и сложной в выполнении, а сортировка клеток может изменить клеточные фенотипические профили5.
Новый подход к оценке эпигеномных и транскриптомных профилей, специфичных для типа клеток яичников, использует модель мыши с ядерным мечением и трансляцией очистки аффинности рибосом (NuTRAP). Модель NuTRAP позволяет выделять нуклеиновые кислоты, специфичные для клеточного типа, без необходимости сортировки клеток, используя методы аффинной очистки: трансляцию очистки аффинности рибосом (TRAP) и выделение ядер, меченных в определенных типах клеток (INTACT)6. Экспрессия аллеля NuTRAP находится под контролем флоксированной кассеты STOP и может быть нацелена на определенные типы клеток яичников с использованием промотор-специфических линий Cre. При скрещивании мыши NuTRAP с клеточно-специфической линией Cre удаление кассеты STOP вызывает eGFP-мечение рибосомного комплекса и биотин/mCherry-мечение ядра Cre-зависимым образом6. Затем методы TRAP и INTACT могут быть использованы для выделения мРНК и ядерной ДНК из интересующего типа клеток и перехода к транскриптомному и эпигеномному анализу.
Модель NuTRAP использовалась в различных тканях, таких как жировая ткань6, мозговая ткань 7,8,9 и сетчатка10, для выявления специфических для клеточного типа эпигеномных и транскриптомных изменений, которые не могут быть обнаружены в гомогенате цельных тканей. Преимущества подхода NuTRAP по сравнению с традиционными методами сортировки клеток включают следующее: 1) предотвращение активационных артефактов ex vivo 8, 2) минимизация потребности в специализированном оборудовании (например, сортировщиках клеток) и 3) увеличение пропускной способности и снижение стоимости анализов, специфичных для типа клеток. Кроме того, способность выделять специфическую для клеточного типа ДНК и РНК от одной мыши позволяет проводить парные анализы, которые увеличивают статистическую мощность. Поскольку недавние исследования показали, что стромальные клетки яичников приводят к преждевременному старению фенотипов 11,12,13, мы нацелили систему экспрессии NuTRAP на стромальные и тека-клетки с помощью драйвера Cyp17a1-Cre. Здесь мы демонстрируем, что индукция конструкции NuTRAP специфична для стромальных и тека-клеток яичников, а достаточное количество ДНК и РНК для исследований секвенирования получено из одного яичника. Представленная здесь модель и методы NuTRAP могут быть использованы для изучения любого типа клеток яичников с любой доступной линией Cre.
Для генерации клеточного тип-специфической линии мышей NuTRAP яичников аллель ядерной маркировки и трансляции очистки аффинности рибосом (NuTRAP) имеет флоксированный кодон STOP, который контролирует экспрессию BirA, пептида распознавания биотинлигазы (BLRP), меченного mCherry/mRANGAP1, и eGFP/L10a. При скрещивании с клеточно-специфической линией Cre экспрессия кассеты NuTRAP мечет ядерный белок mRANGAP1 биотином/mCherry и рибосомный белок L10a с eGFP Cre-зависимым образом. Это позволяет выделять ядра и мРНК из определенных типов клеток без необходимости сортировки клеток. NuTRAP flox/flox может быть сопряжен со специфическим для клеточного типа Cre, относящимся к типам клеток яичников, чтобы оценить это.
Protocol
Representative Results
Discussion
Мышиная модельNuTRAP 6 представляет собой мощный подход к трансгенной маркировке для парного опроса транскриптома и эпигенома из определенных типов клеток, которые могут быть адаптированы к любому типу клеток с доступным драйвером Cre. Здесь мы демонстрируем специфичность мы…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Эта работа была поддержана грантами Национальных институтов здравоохранения (NIH) (R01AG070035, R01AG069742, T32AG052363), BrightFocus Foundation (M2020207) и Presbyterian Health Foundation. Эта работа также была частично поддержана наградой MERIT I01BX003906 и наградой Shared Equipment Evaluation Program (ShEEP) ISIBX004797 из Соединенных Штатов (США). Департамент по делам ветеранов, Служба исследований и разработок биомедицинских лабораторий. Авторы также хотели бы поблагодарить Центр клинической геномики (OMRF) и Центр визуализации (OMRF) за помощь и использование инструментов.
Materials
| 0.1 M Spermidine | Sigma-Aldrich | 05292-1ML-F | |
| 1 M MgCl2 | Thermo Scientific | AM9530G | |
| 10% NP-40 | Thermo Scientific | 85124 | |
| 100 mg/mL Cycloheximide | Sigma-Aldrich | C4859-1ML | |
| 2-mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | M3148 | |
| 30 µm cell strainer | Miltenyi Biotec | 130-098-458 | |
| All Prep DNA/RNA Mini Kit | Qiagen | 80204 | |
| anti-GFP antibody | Abcam | Ab290 | For TRAP and IHC (Rabbit polyclonal to GFP) |
| Buffer RLT | Qiagen | 79216 | RNA Lysis Buffer in protocol |
| cOmplete, mini, EDTA-free protease inhibitor tablet | Roche | 11836170001 | For TRAP Homogenization Buffer |
| Cyp17iCre mouse model | The Jackson Laboratory | 28547 | B6;SJL-Tg(Cyp17a1-icre)AJako/J |
| DynaMag-2 magnet | Invitrogen | 12321D | |
| Genotyping Primers | IDT | Custom | Generic Cre – Jackson Laboratory protocol 22392, Primers: oIMR1084, oIMR1085, oIMR7338, oIMR7339 |
| Cyp17iCre – Jackson Laboratory protocol 30847, Primers: 21218, 31704, 31705, 35663 | |||
| NuTRAP – Jackson Laboratory protocol 21509, Primers: 21306, 24493, 32625, 32626 | |||
| Halt Protease Inhibitor cocktail (100X) | Thermo Scientific | 1861278 | For NPB Buffer |
| M-280 Streptavidin Dynabeads | Invitrogen | 11205D | 2.8 µm bead diameter |
| MixMate | Eppendorf | 5353000529 | |
| Nuclei Isolation Kit: Nuclei EZ Prep | Sigma-Aldrich | Nuc101 | Contains Nuclei Lysis Buffer and Nuclei Storage Buffer |
| 1 M HEPES | Gibco | 15630-080 | |
| 5 M NaCl | Thermo Scientific | AM9760G | |
| 2M KCl | Thermo Scientific | AM9640G | |
| 0.5 M EDTA | Thermo Scientific | AM9260G | |
| 0.5 M EGTA | Fisher Scientific | 50-255-956 | |
| NuTRAP mouse model | The Jackson Laboratory | 29899 | B6;129S6-Gt(ROSA)26Sortm2(CAG-NuTRAP)Evdr/J |
| Pierce DTT No-Weigh Format | Thermo Scientific | A39255 | |
| Protein G Dynabeads | ThermoFisher | 10004D | For TRAP |
| RNaseOUT | Invitrogen | 10777019 | |
| Sodium Heparin | Fisher Scientific | BP2425 | |
| Ultrapure 1M Tris-HCl, pH 7.5 | Invitrogen | 15567-027 | |
| VWR Tube Rotator | Fisher Scientific | NC9854190 |
References
- Broekmans, F. J., Soules, M. R., Fauser, B. C. Ovarian aging: Mechanisms and clinical consequences. Endocrine Reviews. 30 (5), 465-493 (2009).
- Cheng, L., et al. Laser-assisted microdissection in translational research: Theory, technical considerations, and future applications. Applied Immunohistochemistry & Molecular Morphology. 21 (1), 31-47 (2013).
- Morris, M. E., et al. A single-cell atlas of the cycling murine ovary. eLife. 11, 77239 (2022).
- Kendrick, H., et al. Transcriptome analysis of mammary epithelial subpopulations identifies novel determinants of lineage commitment and cell fate. BMC Genomics. 9, 591 (2008).
- Richardson, G. M., Lannigan, J., Macara, I. G. Does FACS perturb gene expression. Cytometry A. 87 (2), 166-175 (2015).
- Roh, H. C., et al. Simultaneous transcriptional and epigenomic profiling from specific cell types within heterogeneous tissues in vivo. Cell Reports. 18 (4), 1048-1061 (2017).
- Chucair-Elliott, A. J., et al. Inducible cell-specific mouse models for paired epigenetic and transcriptomic studies of microglia and astroglia. Communications Biology. 3 (1), 693 (2020).
- Ocanas, S. R., et al. Minimizing the ex vivo confounds of cell-isolation techniques on transcriptomic and translatomic profiles of purified microglia. eNeuro. 9 (2), (2022).
- Raus, A. M., Nelson, N. E., Fuller, T. D., Ivy, A. S. 34;SIT" with Emx1-NuTRAP mice: Simultaneous INTACT and TRAP for paired transcriptomic and epigenetic sequencing. Current Protocols. 2 (10), 570 (2022).
- Chucair-Elliott, A. J., et al. Translatomic response of retinal Muller glia to acute and chronic stress. Neurobiology Disease. 175, 105931 (2022).
- Amargant, F., et al. Ovarian stiffness increases with age in the mammalian ovary and depends on collagen and hyaluronan matrices. Aging Cell. 19 (11), 13259 (2020).
- Briley, S. M., et al. Reproductive age-associated fibrosis in the stroma of the mammalian ovary. Reproduction. 152 (3), 245-260 (2016).
- Umehara, T., et al. Female reproductive life span is extended by targeted removal of fibrotic collagen from the mouse ovary. Science Advances. 8 (24), (2022).
- Lopez-Sanchez, N., Frade, J. M. Cell cycle analysis in the vertebrate brain using immunolabeled fresh cell nuclei. Bio-Protocol. 3 (22), 973 (2013).
- Saccon, T. D., et al. Primordial follicle reserve, DNA damage and macrophage infiltration in the ovaries of the long-living Ames dwarf mice. Experimental Gerontology. 132, 110851 (2020).
- Kinnear, H. M., et al. The ovarian stroma as a new frontier. Reproduction. 160 (3), 25-39 (2020).
- Ajayi, A. F., Akhigbe, R. E. Staging of the estrous cycle and induction of estrus in experimental rodents: an update. Fertility Research and Practice. 6, 5 (2020).
- Tighe, R. M., et al. Improving the quality and reproducibility of flow cytometry in the lung. An official American Thoracic Society workshop report. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 61 (2), 150-161 (2019).
- Zhang, X., et al. Comparative analysis of droplet-based ultra-high-throughput single-cell RNA-Seq systems. Molecular Cell. 73 (1), 130-142 (2019).
- Zheng, G. X., et al. Massively parallel digital transcriptional profiling of single cells. Nature Communications. 8, 14049 (2017).
- Klein, A. M., et al. Droplet barcoding for single-cell transcriptomics applied to embryonic stem cells. Cell. 161 (5), 1187-1201 (2015).
- Macosko, E. Z., et al. Highly parallel genome-wide expression profiling of individual cells using nanoliter droplets. Cell. 161 (5), 1202-1214 (2015).
- Prakadan, S. M., Shalek, A. K., Weitz, D. A. Scaling by shrinking: Empowering single-cell ‘omics’ with microfluidic devices. Nature Reviews Genetics. 18 (6), 345-361 (2017).
- Wang, Q., et al. CoBATCH for high-throughput single-cell epigenomic profiling. Molecular Cell. 76 (1), 206-216 (2019).
- Luo, C., et al. Robust single-cell DNA methylome profiling with snmC-seq2. Nature Communications. 9, 3824 (2018).
- Liu, H., et al. DNA methylation atlas of the mouse brain at single-cell resolution. Nature. 598 (7879), 120-128 (2021).
- Yamawaki, T. M., et al. Systematic comparison of high-throughput single-cell RNA-seq methods for immune cell profiling. BMC Genomics. 22 (1), 66 (2021).
- Hashimshony, T., et al. CEL-Seq2: Sensitive highly-multiplexed single-cell RNA-Seq. Genome Biology. 17, 77 (2016).
- Natarajan, K. N. Single-cell tagged reverse transcription (STRT-Seq). Methods in Molecular Biology. 1979, 133-153 (2019).
- Jaitin, D. A., et al. Massively parallel single-cell RNA-seq for marker-free decomposition of tissues into cell types. Science. 343 (6172), 776-779 (2014).
- Aldridge, S., Teichmann, S. A. Single cell transcriptomics comes of age. Nature Communications. 11, 4307 (2020).
- Clark, S. J., Lee, H. J., Smallwood, S. A., Kelsey, G., Reik, W. Single-cell epigenomics: Powerful new methods for understanding gene regulation and cell identity. Genome Biology. 17, 72 (2016).
- Christensson, E., Lewan, L. The use of spermidine for the isolation of nuclei from mouse liver. Studies of purity and yield during different physiological conditions. Zeitschrift für Naturforschung. Section C, Biosciences. 29 (5-6), 267-271 (1974).
- Levine, M. E., et al. Menopause accelerates biological aging. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (33), 9327-9332 (2016).
- Ossewaarde, M. E., et al. Age at menopause, cause-specific mortality and total life expectancy. Epidemiology. 16 (4), 556-562 (2005).
- Wellons, M., Ouyang, P., Schreiner, P. J., Herrington, D. M., Vaidya, D. Early menopause predicts future coronary heart disease and stroke: the Multi-Ethnic Study of Atherosclerosis. Menopause. 19 (10), 1081-1087 (2012).
- Camaioni, A., et al. The process of ovarian aging: It is not just about oocytes and granulosa cells. Journal of Assisted Reproduction and Genetics. 39 (4), 783-792 (2022).
