Knockdown von FAM83A zum Nachweis seiner Rolle beim Zellwachstum von Gebärmutterhalskrebs und der Sensitivität von Cisplatin
Summary
Hier zeigen wir die Verfahren für den FAM83A-Knockdown ; die Assays zum Nachweis seiner Auswirkungen auf die Proliferation, Migration und Invasion von Gebärmutterhalskrebszellen; und die Sensibilisierung dieser Zellen gegenüber Cisplatin. Diese Studie liefert ein vielversprechendes Zielgen für Gebärmutterhalskrebs und eine Referenz für die weitere Medikamentenforschung.
Abstract
Die Erforschung von Tumorzielgenen ist für die Prävention und Behandlung von Gebärmutterhalskrebs von größter Bedeutung. In dieser Studie skizzieren wir die Schritte zur Identifizierung eines Tumor-Zielgens FAM83A bei Gebärmutterhalskrebs. Zunächst wurde der Datensatz des Cancer Genome Atlas verwendet, um die Expression und prognostische Bedeutung von FAM83A bei Frauen zu validieren. Eine kleine interferierende RNA (siRNA) wurde für den Knockdown des FAM83A-Gens in HeLa- und C33a-Zellen verwendet. Als nächstes wurde eine 5-Ethinyl-2′-Desoxyuridin (EdU)-Färbung durchgeführt, um die Auswirkungen auf die Proliferationsfähigkeit der Tumorzellen zu bestimmen. Wundheilungs- und poröse Membraninsert-Assays wurden durchgeführt, um die Migration und Invasionsfähigkeit von Tumorzellen zu bewerten.
Western Blot wurde verwendet, um Apoptose-assoziierte Proteinspiegel zu quantifizieren. Die JC-1-Färbung wurde verwendet, um Veränderungen der mitochondrialen Funktion zu bewerten. Darüber hinaus wurde die Intervention mit Cisplatin (Diamindichlorplatin, DDP) eingesetzt, um das therapeutische Potenzial des Zielgens zu bewerten. Durchflusszytometrie und Koloniebildungsassays wurden durchgeführt, um die krebshemmenden Eigenschaften des Gens weiter zu validieren. Infolgedessen wurde gezeigt, dass der FAM83A-Knockdown die Proliferation, Migration und Invasion von Gebärmutterhalskrebszellen hemmt und diese Zellen für Cisplatin sensibilisiert. Diese umfassenden Methoden validieren FAM83A als tumorassoziiertes Zielgen, das als potenzielles therapeutisches Ziel in der Prävention und Behandlung von Gebärmutterhalskrebs vielversprechend ist.
Introduction
Gebärmutterhalskrebs ist ein globales Problem, da es eine der weltweit führenden Arten von gynäkologischen Malignomen ist und die Hauptursache für krebsbedingte Todesfälle bei Frauen ist1. Radikale Operationen und Radiochemotherapie sind mit hohen Heilungsraten im Primärstadium verbunden. Die Behandlungsergebnisse für Patientinnen im fortgeschrittenen Stadium des Gebärmutterhalskrebses, die eine metastasierende Erkrankung entwickeln, sind jedoch sehr ungünstig2. Daher ist es von entscheidender Bedeutung, die biologischen Mechanismen, die der Migration und Invasion von Gebärmutterhalskrebszellen zugrunde liegen, besser zu verstehen und potenzielle therapeutische Ziele für die Vorbeugung und Behandlung dieser Krankheit zu identifizieren.
Die Identifizierung von Zielgenen, die an der Krebsprogression beteiligt sind, und die Suche nach Wegen, ihre Expression oder Wirkung zu hemmen, stellen vielversprechende Behandlungsoptionen dar. In dieser Studie identifizierten wir FAM83 als krebserregendes Gen und untersuchten seine hemmende Wirkung auf C33a– und HeLa-Zellen. Onkogene der FAM83-Familie (FAM83A-H) sind bei Krebserkrankungen beim Menschen weit verbreitet 3,4. Kürzlich wurde berichtet, dass FAM83A bei Lungenkrebs5,Brustkrebs 6, Eierstockkrebs7 und Bauchspeicheldrüsenkrebs8 hochreguliert ist, was darauf hindeutet, dass FAM83A eine wichtige Rolle bei der Krebsprogression spielt, indem es die Proliferation, Invasion, stammzellähnliche Merkmale und Arzneimittelresistenz in den Tumorzellen fördert. Wichtig ist, dass FAM83A als eines der neuen Kandidatengene identifiziert wurde, die mit der Progression zervikaler Läsionen und der Karzinogenese assoziiertsind 9. Trotz der Bestätigung einer erhöhten FAM83A-Expression in menschlichen Gebärmutterhalskrebszellen sind die spezifischen Auswirkungen und die zugrunde liegenden Mechanismen von FAM83A bei Gebärmutterhalskrebs nach wie vor unklar.
In dieser Studie skizzieren wir die Protokolle zur Identifizierung von FAM83A als Tumorzielgen bei Gebärmutterhalskrebs und verwenden eine kleine interferierende RNA (siRNA) für den Knockdown des FAM83A-Gens in HeLa- und C33a-Zellen . Eine 5-Ethynyl-2′-Desoxyuridin (EdU)-Färbung wurde durchgeführt, um die Auswirkungen auf die Tumorzellproliferation zu bestimmen, während Wundheilungs- und poröse Membraninsert-Assays dazu beitrugen, die Migration und Invasionsfähigkeit von Tumorzellen zu bewerten.
Western Blot wurde durchgeführt, um die Konzentrationen von Apoptose-verwandten Proteinen zu bestimmen, und JC-1-Färbung wurde verwendet, um mitochondriale Funktionsänderungen zu bewerten. So berichteten wir, dass FAM83A eine entscheidende Rolle bei der Zellproliferation, Metastasierung und Invasion bei Gebärmutterhalskrebs spielt. Durch PI3K/AKT-Signalweg-assoziierte mitochondriale Dysfunktion und Apoptose sensibilisierte FAM83A Gebärmutterhalskrebszellen für Cisplatin (Diamindichlorplatin, DDP). Diese Studie bietet ein neues Ziel für Gebärmutterhalskrebs und möglicherweise andere Krebsarten und eine Referenz für die Entwicklung von Strategien zur Überwindung der Resistenz von Krebszellen gegen bestimmte Chemotherapeutika.
Protocol
Representative Results
Discussion
Die Untersuchung von Tumor-Zielgenen ist sowohl für die Prävention als auch für die Behandlung von Gebärmutterhalskrebs von größter Bedeutung. Das Verständnis der spezifischen Gene, die eine wichtige Rolle bei der Entstehung und dem Fortschreiten von Gebärmutterhalskrebs spielen, bietet wertvolle Einblicke in die zugrunde liegenden molekularen Mechanismen der Krankheit. Darüber hinaus kann die Identifizierung dieser Zielgene zur Entwicklung neuartiger therapeutischer Strategien und zielgerichteter Therapien füh…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Arbeit wurde von der Jingzhou Science and Technology Bureau Foundation unterstützt (Nr. 2020HC06).
Materials
| Cells and Medium Formulation | |||
| C33a | American Type Culture Collection | ||
| Hela | American Type Culture Collection | ||
| Modified medium | 10% fetal bovine serum and + antibiotics (100 U/mL penicillin and 100 U/mL streptomycin) | ||
| Antibody Information | |||
| AKT | 4691, Cell Signaling Technology Inc. | ‘1:1,000 | |
| Bcl2 | 26593-1-AP, Proteintech Group, Inc | ‘1:1,000 | |
| Caspase 3 | 19677-1-AP, Proteintech Group, Inc | ‘1:2,000 | |
| cleaved-caspase3 | abs132005; Absin Bioscience Inc. | ‘1:1,000 | |
| Cytc | 10993-1-AP; Proteintech Group | ‘1:1,000 | |
| GAPDH | 10494-1-AP, Proteintech Group, Inc. | ‘1:8,000 | |
| mTOR | 2983, Cell Signaling Technology Inc. | ‘1:1,000 | |
| PI3K | 4292, Cell Signaling Technology Inc | ‘1:1,000 | |
| p-AKT | 4060, Cell Signaling Technology Inc. | ‘1:1,000 | |
| p-mTOR (Ser2448) | #5536, Cell Signaling Technology Inc. | ‘1:1,000 | |
| p-PI3K p85 subunit | 17366, Cell Signaling Technology Inc. | ‘1:1,000 | |
| Secondary antibodies | GB23303, Servicebio | ‘1:2,000 | |
| Materials | |||
| 6-well plate | Corning, NPY | ||
| Alexa Fluor 555 | Beyotime | ||
| BCA Protein assay kit | Beyotime, China | P0011 | |
| ChemiDoc XRS Imager System | BioRad | ||
| Enhanced chemiluminescence detection kit | Servicebio, Inc.,China | cat. no. G2014 | |
| Fluorescence microscope | Olympus Corporation, Tokyo, Japan | ||
| Hifair II 1st Strand cDNA Synthesis Super Mix | 11123ES60, Yeasen Biotech o., Ltd., China | ||
| Inverted microscope | Olympus, Tokyo, Japan; | ||
| Millicell transwell inserts | Millipore,Bedford, MA, USA | ||
| Mitochondrial membrane potential assay kit | Beyotime, China | ||
| PMSF | ST506, Beyotime Biotech, Jiangsu, China | #ST506 | |
| Real-time quantitative PCR instrument | Applied Biosystems, Thermo Fisher Scientific. China. | ||
| RIPA Lysis Buffer | Beyotime Biotech, Jiangsu, China | ||
| TRIzol reagent | Invitrogen | 15596026 | |
| TRIzol reagent | Takara Bio Inc., Otsu, Japan | ||
| Software | |||
| Image-Pro | plus 6.0 | ||
References
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