Knockdown de FAM83A para verificar seu papel no crescimento de células de câncer cervical e sensibilidade à cisplatina
Summary
Aqui, mostramos os procedimentos para knockdown do FAM83A ; os ensaios para detectar seus efeitos sobre a proliferação, migração e invasão de células de câncer cervical; e a sensibilização dessas células à cisplatina. Este estudo fornece um gene alvo promissor para o câncer cervical e uma referência para futuras pesquisas de drogas.
Abstract
A exploração de genes-alvo tumorais é de suma importância para a prevenção e tratamento do câncer cervical. Neste estudo, descrevemos as etapas envolvidas na identificação de um gene alvo tumoral FAM83A no câncer cervical. Primeiro, o conjunto de dados do Atlas do Genoma do Câncer foi empregado para validar a expressão e o significado prognóstico de FAM83A em mulheres. Um pequeno RNA de interferência (siRNA) foi usado para knockdown do gene FAM83A em células HeLa e C33a . Em seguida, a coloração de 5-etinil-2′-desoxiuridina (EdU) foi conduzida para determinar os efeitos sobre a capacidade de proliferação das células tumorais. Ensaios de cicatrização de feridas e inserção de membrana porosa foram realizados para avaliar a capacidade de migração e invasão de células tumorais.
Western blotting foi usado para quantificar os níveis de proteína relacionada à apoptose. A coloração JC-1 foi empregada para avaliar alterações da função mitocondrial. Além disso, a intervenção com cisplatina (diaminedicloroplatina, DDP) foi utilizada para avaliar o potencial terapêutico do gene alvo. Citometria de fluxo e ensaios de formação de colônias foram conduzidos para validar ainda mais as características anticâncer do gene. Como resultado, o knockdown de FAM83A mostrou inibir a proliferação, migração e invasão de células de câncer cervical e sensibilizar essas células à cisplatina. Essas metodologias abrangentes validam coletivamente o FAM83A como um gene-alvo associado ao tumor, sendo promissor como um alvo terapêutico potencial na prevenção e tratamento do câncer cervical.
Introduction
O câncer do colo do útero é uma preocupação mundial, pois é um dos principais tipos de neoplasia ginecológica no mundo e é a principal causa de mortalidade relacionada ao câncer emmulheres1. A cirurgia radical e a quimiorradioterapia estão associadas a altas taxas de cura no estágio primário. No entanto, os resultados do tratamento para pacientes em estágio avançado de câncer de colo uterino que desenvolvem doença metastática são muito desfavoráveis2. Portanto, é crucial compreender melhor os mecanismos biológicos subjacentes à migração e invasão de células cancerosas do colo do útero e identificar potenciais alvos terapêuticos para a prevenção e tratamento desta doença.
Identificar genes-alvo envolvidos na progressão do câncer e encontrar maneiras de inibir sua expressão ou ação apresentam opções promissoras de tratamento. Neste estudo, identificamos FAM83 como um gene causador de câncer e investigamos seus efeitos inibitórios em células C33a e HeLa. Os oncogenes da família FAM83 (FAM83A-H) são amplamente relatados em cânceres humanos 3,4. Recentemente, foi relatado que o FAM83A é upregulated em cânceres de pulmão5, mama6, ovário7 e pâncreas8, indicando que o FAM83A desempenha um papel importante na progressão do câncer por meio da promoção da proliferação, invasão, características semelhantes a células-tronco e resistência a drogas nas células tumorais. É importante ressaltar que o FAM83A foi identificado como um dos novos genes candidatos associados à progressão da lesão cervical e carcinogênese9. Apesar da confirmação da expressão elevada de FAM83A em células humanas de câncer cervical, o impacto específico e os mecanismos subjacentes de FAM83A no câncer cervical permanecem obscuros.
Neste estudo, delineamos os protocolos envolvidos na identificação de FAM83A como um gene alvo tumoral em câncer cervical e usamos um pequeno RNA de interferência (siRNA) para o knockdown do gene FAM83A em células HeLa e C33a . A coloração com 5-etinil-2′-desoxiuridina (EdU) foi realizada para determinar os efeitos sobre a proliferação de células tumorais, enquanto os ensaios de cicatrização de feridas e inserção de membrana porosa ajudaram a avaliar a migração e a capacidade de invasão de células tumorais.
Western blotting foi realizado para determinar os níveis de proteínas relacionadas à apoptose, e a coloração JC-1 foi empregada para avaliar alterações da função mitocondrial. Assim, relatamos que o FAM83A desempenha um papel crítico na proliferação celular, metástase e invasão no câncer cervical. Através da disfunção mitocondrial e apoptose associadas à via PI3K/AKT, o knockdown FAM83A sensibilizou células de câncer cervical à cisplatina (diaminedicloroplatina, DDP). Este estudo fornece um novo alvo para o câncer do colo do útero e possivelmente outros cânceres e uma referência para o desenvolvimento de estratégias para superar a resistência das células cancerosas a certas drogas quimioterápicas.
Protocol
Representative Results
Discussion
A investigação de genes-alvo tumorais é de extrema importância tanto para a prevenção quanto para o tratamento do câncer cervical. A compreensão dos genes específicos que desempenham um papel significativo no desenvolvimento e progressão do câncer cervical fornece informações valiosas sobre os mecanismos moleculares subjacentes da doença. Além disso, a identificação desses genes-alvo pode levar ao desenvolvimento de novas estratégias terapêuticas e terapias-alvo. Neste estudo, descrevemos o uso da aná…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabalho foi apoiado pela Fundação do Departamento de Ciência e Tecnologia de Jingzhou (nº 2020HC06).
Materials
| Cells and Medium Formulation | |||
| C33a | American Type Culture Collection | ||
| Hela | American Type Culture Collection | ||
| Modified medium | 10% fetal bovine serum and + antibiotics (100 U/mL penicillin and 100 U/mL streptomycin) | ||
| Antibody Information | |||
| AKT | 4691, Cell Signaling Technology Inc. | ‘1:1,000 | |
| Bcl2 | 26593-1-AP, Proteintech Group, Inc | ‘1:1,000 | |
| Caspase 3 | 19677-1-AP, Proteintech Group, Inc | ‘1:2,000 | |
| cleaved-caspase3 | abs132005; Absin Bioscience Inc. | ‘1:1,000 | |
| Cytc | 10993-1-AP; Proteintech Group | ‘1:1,000 | |
| GAPDH | 10494-1-AP, Proteintech Group, Inc. | ‘1:8,000 | |
| mTOR | 2983, Cell Signaling Technology Inc. | ‘1:1,000 | |
| PI3K | 4292, Cell Signaling Technology Inc | ‘1:1,000 | |
| p-AKT | 4060, Cell Signaling Technology Inc. | ‘1:1,000 | |
| p-mTOR (Ser2448) | #5536, Cell Signaling Technology Inc. | ‘1:1,000 | |
| p-PI3K p85 subunit | 17366, Cell Signaling Technology Inc. | ‘1:1,000 | |
| Secondary antibodies | GB23303, Servicebio | ‘1:2,000 | |
| Materials | |||
| 6-well plate | Corning, NPY | ||
| Alexa Fluor 555 | Beyotime | ||
| BCA Protein assay kit | Beyotime, China | P0011 | |
| ChemiDoc XRS Imager System | BioRad | ||
| Enhanced chemiluminescence detection kit | Servicebio, Inc.,China | cat. no. G2014 | |
| Fluorescence microscope | Olympus Corporation, Tokyo, Japan | ||
| Hifair II 1st Strand cDNA Synthesis Super Mix | 11123ES60, Yeasen Biotech o., Ltd., China | ||
| Inverted microscope | Olympus, Tokyo, Japan; | ||
| Millicell transwell inserts | Millipore,Bedford, MA, USA | ||
| Mitochondrial membrane potential assay kit | Beyotime, China | ||
| PMSF | ST506, Beyotime Biotech, Jiangsu, China | #ST506 | |
| Real-time quantitative PCR instrument | Applied Biosystems, Thermo Fisher Scientific. China. | ||
| RIPA Lysis Buffer | Beyotime Biotech, Jiangsu, China | ||
| TRIzol reagent | Invitrogen | 15596026 | |
| TRIzol reagent | Takara Bio Inc., Otsu, Japan | ||
| Software | |||
| Image-Pro | plus 6.0 | ||
References
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