Rahim Ağzı Kanseri Hücre Büyümesi ve Sisplatin Duyarlılığındaki Rolünü Doğrulamak için FAM83A'nın Yıkılması
Summary
Burada, FAM83A yıkım prosedürlerini gösteriyoruz; rahim ağzı kanseri hücrelerinin çoğalması, göçü ve istilası üzerindeki etkilerini tespit etmek için yapılan tahliller; ve bu hücrelerin sisplatine duyarlılığı. Bu çalışma, rahim ağzı kanseri için umut verici bir hedef gen ve daha ileri ilaç araştırmaları için bir referans sağlar.
Abstract
Tümör hedef genlerinin araştırılması, rahim ağzı kanserinin önlenmesi ve tedavisi için büyük önem taşımaktadır. Bu çalışmada, rahim ağzı kanserinde bir tümör hedef geni FAM83A’nın tanımlanmasında yer alan adımları özetledik. İlk olarak, kadınlarda FAM83A’nın ekspresyonunu ve prognostik önemini doğrulamak için Kanser Genom Atlası veri seti kullanıldı. HeLa ve C33a hücrelerinde FAM83A geninin yıkılması için küçük bir enterferans yapan RNA (siRNA) kullanıldı. Daha sonra, tümör hücrelerinin proliferasyon yetenekleri üzerindeki etkilerini belirlemek için 5-etinil-2′-deoksiüridin (EdU) boyaması yapıldı. Tümör hücre göçü ve invazyon yeteneklerini değerlendirmek için yara iyileşmesi ve gözenekli membran insert testleri yapıldı.
Apoptozla ilişkili protein seviyelerini ölçmek için Western blotlama kullanıldı. Mitokondriyal fonksiyon değişikliklerini değerlendirmek için JC-1 boyaması kullanıldı. Ayrıca, hedef genin terapötik potansiyelini değerlendirmek için sisplatin (diamindikloroplatin, DDP) müdahalesi kullanıldı. Genin antikanser özelliklerini daha fazla doğrulamak için akış sitometrisi ve koloni oluşumu testleri yapıldı. Sonuç olarak, FAM83A yıkımının rahim ağzı kanseri hücrelerinin çoğalmasını, göçünü ve istilasını inhibe ettiği ve bu hücreleri sisplatine duyarlı hale getirdiği gösterilmiştir. Bu kapsamlı metodolojiler, FAM83A’yı tümörle ilişkili bir hedef gen olarak toplu olarak doğrular ve rahim ağzı kanserinin önlenmesi ve tedavisinde potansiyel bir terapötik hedef olarak umut vaat eder.
Introduction
Rahim ağzı kanseri, dünya çapında jinekolojik malignitelerin önde gelen türlerinden biri olduğu ve kadınlarda kansere bağlı ölümlerin başlıca nedeni olduğu için küresel bir sorundur1. Radikal cerrahi ve kemoradyoterapi, birincil aşamada yüksek kür oranları ile ilişkilidir. Bununla birlikte, rahim ağzı kanserinin ileri evresinde metastatik hastalık gelişen hastalar için tedavi sonuçları çok elverişsizdir2. Bu nedenle, rahim ağzı kanseri hücrelerinin göçünün ve istilasının altında yatan biyolojik mekanizmaları daha iyi anlamak ve bu hastalığın önlenmesi ve tedavisi için potansiyel terapötik hedefleri belirlemek çok önemlidir.
Kanserin ilerlemesinde rol oynayan hedef genlerin belirlenmesi ve ekspresyonlarını veya etkilerini engellemenin yollarını bulmak umut verici tedavi seçenekleri sunar. Bu çalışmada, FAM83’ü kansere neden olan bir gen olarak tanımladık ve C33a ve HeLa hücreleri üzerindeki inhibitör etkilerini daha fazla araştırdık. FAM83 ailesi onkogenleri (FAM83A-H) insan kanserlerinde yaygın olarak bildirilmiştir 3,4. Son zamanlarda, FAM83A’nın akciğer5, meme6, yumurtalık7 ve pankreas8 kanserlerinde yukarı regüle olduğu bildirildi, bu da FAM83A’nın tümör hücrelerinde proliferasyon, invazyon, kök hücre benzeri özellikler ve ilaç direncini teşvik ederek kanserin ilerlemesinde önemli bir rol oynadığını gösteriyor. Önemli olarak, FAM83A, servikal lezyon progresyonu ve karsinogenez9 ile ilişkili yeni aday genlerden biri olarak tanımlanmıştır. İnsan rahim ağzı kanseri hücrelerinde artmış FAM83A ekspresyonunun doğrulanmasına rağmen, FAM83A’nın rahim ağzı kanserindeki spesifik etkisi ve altta yatan mekanizmaları belirsizliğini korumaktadır.
Bu çalışmada, rahim ağzı kanserinde FAM83A’nın bir tümör hedef geni olarak tanımlanmasında yer alan protokolleri özetledik ve HeLa ve C33a hücrelerinde FAM83A geninin yıkılması için küçük bir enterferans yapan RNA (siRNA) kullandık. Tümör hücresi proliferasyonu üzerindeki etkilerini belirlemek için 5-Etinil-2′-deoksiüridin (EdU) boyaması yapılırken, yara iyileşmesi ve gözenekli membran ekleme testleri tümör hücresi göçü ve invazyon yeteneklerinin değerlendirilmesine yardımcı oldu.
Apoptozla ilişkili proteinlerin seviyelerini belirlemek için Western blotlama yapıldı ve mitokondriyal fonksiyon değişikliklerini değerlendirmek için JC-1 boyaması kullanıldı. Bu nedenle, FAM83A’nın serviks kanserinde hücre proliferasyonu, metastaz ve invazyonunda kritik bir rol oynadığını bildirdik. PI3K / AKT yolu ile ilişkili mitokondriyal disfonksiyon ve apoptoz yoluyla, FAM83A nakavt rahim ağzı kanseri hücrelerini sisplatine (diamindikloroplatin, DDP) duyarlı hale getirdi. Bu çalışma, rahim ağzı kanseri ve muhtemelen diğer kanserler için yeni bir hedef ve kanser hücrelerinin belirli kemoterapötik ilaçlara karşı direncinin üstesinden gelmek için stratejilerin geliştirilmesi için bir referans sunmaktadır.
Protocol
Representative Results
Discussion
Tümör hedef genlerinin araştırılması, rahim ağzı kanserinin hem önlenmesi hem de tedavisi için son derece önemlidir. Rahim ağzı kanseri gelişiminde ve ilerlemesinde önemli bir rol oynayan spesifik genlerin anlaşılması, hastalığın altında yatan moleküler mekanizmalar hakkında değerli bilgiler sağlar. Ayrıca, bu hedef genlerin belirlenmesi, yeni terapötik stratejilerin ve hedefe yönelik tedavilerin geliştirilmesine yol açabilir. Bu çalışmada, FAM83A’yı hedef gen olarak tanımlama…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu çalışma Jingzhou Bilim ve Teknoloji Bürosu Vakfı (no. 2020HC06) tarafından desteklenmiştir.
Materials
| Cells and Medium Formulation | |||
| C33a | American Type Culture Collection | ||
| Hela | American Type Culture Collection | ||
| Modified medium | 10% fetal bovine serum and + antibiotics (100 U/mL penicillin and 100 U/mL streptomycin) | ||
| Antibody Information | |||
| AKT | 4691, Cell Signaling Technology Inc. | ‘1:1,000 | |
| Bcl2 | 26593-1-AP, Proteintech Group, Inc | ‘1:1,000 | |
| Caspase 3 | 19677-1-AP, Proteintech Group, Inc | ‘1:2,000 | |
| cleaved-caspase3 | abs132005; Absin Bioscience Inc. | ‘1:1,000 | |
| Cytc | 10993-1-AP; Proteintech Group | ‘1:1,000 | |
| GAPDH | 10494-1-AP, Proteintech Group, Inc. | ‘1:8,000 | |
| mTOR | 2983, Cell Signaling Technology Inc. | ‘1:1,000 | |
| PI3K | 4292, Cell Signaling Technology Inc | ‘1:1,000 | |
| p-AKT | 4060, Cell Signaling Technology Inc. | ‘1:1,000 | |
| p-mTOR (Ser2448) | #5536, Cell Signaling Technology Inc. | ‘1:1,000 | |
| p-PI3K p85 subunit | 17366, Cell Signaling Technology Inc. | ‘1:1,000 | |
| Secondary antibodies | GB23303, Servicebio | ‘1:2,000 | |
| Materials | |||
| 6-well plate | Corning, NPY | ||
| Alexa Fluor 555 | Beyotime | ||
| BCA Protein assay kit | Beyotime, China | P0011 | |
| ChemiDoc XRS Imager System | BioRad | ||
| Enhanced chemiluminescence detection kit | Servicebio, Inc.,China | cat. no. G2014 | |
| Fluorescence microscope | Olympus Corporation, Tokyo, Japan | ||
| Hifair II 1st Strand cDNA Synthesis Super Mix | 11123ES60, Yeasen Biotech o., Ltd., China | ||
| Inverted microscope | Olympus, Tokyo, Japan; | ||
| Millicell transwell inserts | Millipore,Bedford, MA, USA | ||
| Mitochondrial membrane potential assay kit | Beyotime, China | ||
| PMSF | ST506, Beyotime Biotech, Jiangsu, China | #ST506 | |
| Real-time quantitative PCR instrument | Applied Biosystems, Thermo Fisher Scientific. China. | ||
| RIPA Lysis Buffer | Beyotime Biotech, Jiangsu, China | ||
| TRIzol reagent | Invitrogen | 15596026 | |
| TRIzol reagent | Takara Bio Inc., Otsu, Japan | ||
| Software | |||
| Image-Pro | plus 6.0 | ||
References
- Arbyn, M., et al. Estimates of incidence and mortality of cervical cancer in 2018: a worldwide analysis. Lancet Global Health. 8 (2), e191-e203 (2020).
- Cohen, P. A., Jhingran, A., Oaknin, A., Denny, L. Cervical cancer. Lancet. 393 (10167), 169-182 (2019).
- Cipriano, R., et al. Conserved oncogenic behavior of the fam83 family regulates mapk signaling in human cancer. Molecular Cancer Research. 12 (8), 1156-1165 (2014).
- Snijders, A. M., et al. FAM83 family oncogenes are broadly involved in human cancers: an integrative multi-omics approach. Molecular Oncology. 11 (2), 167-179 (2017).
- Gan, J., Meng, Q., Li, Y. Corrigendum: systematic analysis of expression profiles and prognostic significance for fam83 family in non-small-cell lung cancer. Frontiers In Molecular Biosciences. 8, 653454 (2021).
- Jin, Y., et al. Comprehensive analysis of the expression, prognostic significance, and function of fam83 family members in breast cancer. World Journal of Surgical Oncology. 20 (1), 172 (2022).
- Lin, S., et al. Identification of prognostic biomarkers among fam83 family genes in human ovarian cancer through bioinformatic analysis and experimental verification. Cancer Management and Research. 13, 8611-8627 (2021).
- Ma, Z., et al. Identification of prognostic and therapeutic biomarkers among fam83 family members for pancreatic ductal adenocarcinoma. Disease Markers. 2021, 6682697 (2021).
- Xu, J., et al. Genome-wide profiling of cervical RNA-binding proteins identifies human papillomavirus regulation of rnaseh2a expression by viral e7 and e2f1. mBio. 10 (1), e02687-e02618 (2019).
- Wong, R. S. Apoptosis in cancer: from pathogenesis to treatment. Journal Of Experimental & Clinical Cancer Research. 30 (1), 87 (2011).
- Bonora, M., Pinton, P. The mitochondrial permeability transition pore and cancer: molecular mechanisms involved in cell death. Frontiers In Oncology. 4, 302 (2014).
- Wang, N., Hou, M. S., Zhan, Y., Shen, X. B., Xue, H. Y. MALAT1 promotes cisplatin resistance in cervical cancer by activating the pi3k/akt pathway. European Review for Medical and Pharmacological Sciences. 22 (22), 7653-7659 (2018).
- Tsuruta, F., Masuyama, N., Gotoh, Y. The phosphatidylinositol 3-kinase (pi3k)-akt pathway suppresses bax translocation to mitochondria. Journal Of Biological Chemistry. 277 (16), 14040-14047 (2002).
- Guerra, F., Arbini, A. A., Moro, L. Mitochondria and cancer chemoresistance. Biochimica et Biophysica Acta – Bioenergetics. 1858 (8), 686-699 (2017).
- Pustylnikov, S., Costabile, F., Beghi, S., Facciabene, A. Targeting mitochondria in cancer: current concepts and immunotherapy approaches. Translational Research. 202, 35-51 (2018).
