Eliminación de FAM83A para verificar su papel en el crecimiento de células de cáncer de cuello uterino y la sensibilidad al cisplatino
Summary
Aquí, mostramos los procedimientos para el derribo de FAM83A ; los ensayos para detectar sus efectos sobre la proliferación, migración e invasión de las células de cáncer de cuello uterino; y la sensibilización de estas células al cisplatino. Este estudio proporciona un gen diana prometedor para el cáncer de cuello uterino y una referencia para futuras investigaciones farmacológicas.
Abstract
La exploración de los genes diana tumorales es de suma importancia para la prevención y el tratamiento del cáncer de cuello uterino. En este estudio, describimos los pasos involucrados en la identificación de un gen diana tumoral FAM83A en el cáncer de cuello uterino. En primer lugar, se empleó el conjunto de datos del Atlas del Genoma del Cáncer para validar la expresión y la importancia pronóstica de FAM83A en mujeres. Se utilizó un pequeño ARN interferente (siRNA) para la eliminación del gen FAM83A en las células HeLa y C33a . A continuación, se realizó la tinción con 5-etinil-2′-desoxiuridina (EdU) para determinar los efectos sobre la capacidad de proliferación de las células tumorales. Se realizaron ensayos de cicatrización de heridas e inserción de membranas porosas para evaluar la migración de las células tumorales y las capacidades de invasión.
Se utilizó Western blot para cuantificar los niveles de proteínas relacionados con la apoptosis. La tinción con JC-1 se empleó para evaluar las alteraciones de la función mitocondrial. Además, se utilizó la intervención con cisplatino (diaminidicloroplatino, DDP) para evaluar el potencial terapéutico del gen diana. Se realizaron citometrías de flujo y ensayos de formación de colonias para validar aún más las características anticancerosas del gen. Como resultado, se demostró que el knockdown de FAM83A inhibe la proliferación, migración e invasión de las células de cáncer de cuello uterino y sensibiliza a estas células al cisplatino. Estas metodologías integrales validan colectivamente FAM83A como un gen diana asociado a tumores, que es prometedor como una posible diana terapéutica en la prevención y el tratamiento del cáncer de cuello uterino.
Introduction
El cáncer de cuello uterino es una preocupación mundial, ya que es uno de los principales tipos de neoplasias malignas ginecológicas en todo el mundo y es la principal causa de mortalidad relacionada con el cáncer en las mujeres1. La cirugía radical y la quimiorradioterapia se asocian con altas tasas de curación en la etapa primaria. Sin embargo, los resultados del tratamiento para las pacientes en estadio avanzado de cáncer de cuello uterino que desarrollan enfermedad metastásica son muy desfavorables2. Por lo tanto, es crucial comprender mejor los mecanismos biológicos que subyacen a la migración e invasión de las células de cáncer de cuello uterino e identificar posibles dianas terapéuticas para la prevención y el tratamiento de esta enfermedad.
La identificación de genes diana implicados en la progresión del cáncer y la búsqueda de formas de inhibir su expresión o acción presentan opciones de tratamiento prometedoras. En este estudio, identificamos FAM83 como un gen causante de cáncer e investigamos más a fondo sus efectos inhibidores en las células C33a y HeLa. Los oncogenes de la familia FAM83 (FAM83A-H) están ampliamente reportados en cánceres humanos 3,4. Recientemente, se informó que FAM83A está regulado al alza en los cánceres de pulmón5, mama6, ovario7 y páncreas8, lo que indica que FAM83A desempeña un papel importante en la progresión del cáncer al promover la proliferación, la invasión, los rasgos similares a las células madre y la resistencia a los medicamentos en las células tumorales. Es importante destacar que FAM83A se identificó como uno de los nuevos genes candidatos asociados con la progresión de las lesiones cervicales y la carcinogénesis9. A pesar de la confirmación de la expresión elevada de FAM83A en células de cáncer de cuello uterino humano, el impacto específico y los mecanismos subyacentes de FAM83A en el cáncer de cuello uterino siguen sin estar claros.
En este estudio, describimos los protocolos involucrados en la identificación de FAM83A como un gen diana tumoral en el cáncer de cuello uterino y utilizamos un pequeño ARN interferente (siRNA) para la eliminación del gen FAM83A en células HeLa y C33a . Se realizó la tinción con 5-etinil-2′-desoxiuridina (EdU) para determinar los efectos sobre la proliferación de células tumorales, mientras que la cicatrización de heridas y los ensayos de inserción de membranas porosas ayudaron a evaluar la migración de las células tumorales y las capacidades de invasión.
Se realizó Western blot para determinar los niveles de proteínas relacionadas con la apoptosis, y se empleó la tinción de JC-1 para evaluar las alteraciones de la función mitocondrial. Por lo tanto, informamos que FAM83A desempeña un papel crítico en la proliferación celular, la metástasis y la invasión en el cáncer de cuello uterino. A través de la disfunción mitocondrial y la apoptosis asociadas a la vía PI3K/AKT, FAM83A sensibilizó las células de cáncer de cuello uterino al cisplatino (diaminidicloroplatino, DDP). Este estudio proporciona una nueva diana para el cáncer de cuello uterino y posiblemente otros cánceres y una referencia para el desarrollo de estrategias para superar la resistencia de las células cancerosas a ciertos fármacos quimioterapéuticos.
Protocol
Representative Results
Discussion
La investigación de los genes diana tumorales es de suma importancia tanto para la prevención como para el tratamiento del cáncer de cuello uterino. La comprensión de los genes específicos que desempeñan un papel importante en el desarrollo y la progresión del cáncer de cuello uterino proporciona información valiosa sobre los mecanismos moleculares subyacentes de la enfermedad. Además, la identificación de estos genes diana puede conducir al desarrollo de nuevas estrategias terapéuticas y terapias dirigidas. …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabajo contó con el apoyo de la Fundación de la Oficina de Ciencia y Tecnología de Jingzhou (n.º 2020HC06).
Materials
| Cells and Medium Formulation | |||
| C33a | American Type Culture Collection | ||
| Hela | American Type Culture Collection | ||
| Modified medium | 10% fetal bovine serum and + antibiotics (100 U/mL penicillin and 100 U/mL streptomycin) | ||
| Antibody Information | |||
| AKT | 4691, Cell Signaling Technology Inc. | ‘1:1,000 | |
| Bcl2 | 26593-1-AP, Proteintech Group, Inc | ‘1:1,000 | |
| Caspase 3 | 19677-1-AP, Proteintech Group, Inc | ‘1:2,000 | |
| cleaved-caspase3 | abs132005; Absin Bioscience Inc. | ‘1:1,000 | |
| Cytc | 10993-1-AP; Proteintech Group | ‘1:1,000 | |
| GAPDH | 10494-1-AP, Proteintech Group, Inc. | ‘1:8,000 | |
| mTOR | 2983, Cell Signaling Technology Inc. | ‘1:1,000 | |
| PI3K | 4292, Cell Signaling Technology Inc | ‘1:1,000 | |
| p-AKT | 4060, Cell Signaling Technology Inc. | ‘1:1,000 | |
| p-mTOR (Ser2448) | #5536, Cell Signaling Technology Inc. | ‘1:1,000 | |
| p-PI3K p85 subunit | 17366, Cell Signaling Technology Inc. | ‘1:1,000 | |
| Secondary antibodies | GB23303, Servicebio | ‘1:2,000 | |
| Materials | |||
| 6-well plate | Corning, NPY | ||
| Alexa Fluor 555 | Beyotime | ||
| BCA Protein assay kit | Beyotime, China | P0011 | |
| ChemiDoc XRS Imager System | BioRad | ||
| Enhanced chemiluminescence detection kit | Servicebio, Inc.,China | cat. no. G2014 | |
| Fluorescence microscope | Olympus Corporation, Tokyo, Japan | ||
| Hifair II 1st Strand cDNA Synthesis Super Mix | 11123ES60, Yeasen Biotech o., Ltd., China | ||
| Inverted microscope | Olympus, Tokyo, Japan; | ||
| Millicell transwell inserts | Millipore,Bedford, MA, USA | ||
| Mitochondrial membrane potential assay kit | Beyotime, China | ||
| PMSF | ST506, Beyotime Biotech, Jiangsu, China | #ST506 | |
| Real-time quantitative PCR instrument | Applied Biosystems, Thermo Fisher Scientific. China. | ||
| RIPA Lysis Buffer | Beyotime Biotech, Jiangsu, China | ||
| TRIzol reagent | Invitrogen | 15596026 | |
| TRIzol reagent | Takara Bio Inc., Otsu, Japan | ||
| Software | |||
| Image-Pro | plus 6.0 | ||
References
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