Нокдаун FAM83A для проверки его роли в росте клеток рака шейки матки и чувствительности к цисплатину

Summary

Здесь мы покажем процедуры нокдауна FAM83A ; анализы для выявления его влияния на пролиферацию, миграцию и инвазию клеток рака шейки матки; и сенсибилизация этих клеток к цисплатину. Это исследование предоставляет многообещающий ген-мишень для рака шейки матки и эталон для дальнейших исследований лекарственных препаратов.

Abstract

Исследование генов-мишеней опухоли имеет первостепенное значение для профилактики и лечения рака шейки матки. В этом исследовании мы описываем этапы, связанные с идентификацией гена-мишени опухоли FAM83A при раке шейки матки. Во-первых, набор данных Атласа генома рака был использован для проверки экспрессии и прогностической значимости FAM83A у женщин. Малая интерферирующая РНК (миРНК) использовалась для нокдауна гена FAM83A в клетках HeLa и C33a . Затем было проведено окрашивание 5-этинил-2′-дезоксиуридином (EdU) для определения влияния на пролиферативные способности опухолевых клеток. Для оценки способности опухолевых клеток к миграции и инвазии были проведены анализы на заживление ран и вставку пористой мембраны.

Вестерн-блоттинг был использован для количественной оценки уровней белка, связанных с апоптозом. Для оценки изменений функции митохондрий использовали окрашивание JC-1. Кроме того, для оценки терапевтического потенциала гена-мишени было использовано вмешательство цисплатина (диаминдихлорплатины, DDP). Для дальнейшей валидации противоопухолевых характеристик гена были проведены проточная цитометрия и анализ образования колоний. В результате было показано, что нокдаун FAM83A ингибирует пролиферацию, миграцию и инвазию клеток рака шейки матки и сенсибилизирует эти клетки к цисплатину. Эти комплексные методики в совокупности подтверждают, что FAM83A является геном-мишенью, ассоциированным с опухолью, перспективным в качестве потенциальной терапевтической мишени в профилактике и лечении рака шейки матки.

Introduction

Рак шейки матки является глобальной проблемой, поскольку он является одним из ведущих видов гинекологических злокачественных новообразований во всем мире и основной причиной смертности от рака у женщин¹. Радикальная хирургия и химиолучевая терапия связаны с высокими показателями излечения на первичной стадии. Однако результаты лечения пациенток на поздней стадии рака шейки матки, у которых развивается метастатическое заболевание, весьма неблагоприятны². Поэтому крайне важно глубже понять биологические механизмы, лежащие в основе миграции и инвазии клеток рака шейки матки, и определить потенциальные терапевтические мишени для профилактики и лечения этого заболевания.

Идентификация генов-мишеней, участвующих в прогрессировании рака, и поиск способов ингибирования их экспрессии или действия представляют собой многообещающие варианты лечения. В этом исследовании мы идентифицировали FAM83 как ген, вызывающий рак, и дополнительно изучили его ингибирующее воздействие на клетки C33a и HeLa. Онкогены семейства FAM83 (FAM83A-H) широко известны при раке человека ^3,4. Недавно сообщалось о повышенной регуляции FAM83A при раке легких⁵, молочной железы⁶, яичников⁷ и поджелудочной железы⁸, что указывает на то, что FAM83A играет важную роль в прогрессировании рака, способствуя пролиферации, инвазии, признакам, подобным стволовым клеткам, и лекарственной устойчивости опухолевых клеток. Важно отметить, что FAM83A был идентифицирован как один из новых генов-кандидатов, связанных с прогрессированием поражения шейки матки и канцерогенезом⁹. Несмотря на подтверждение повышенной экспрессии FAM83A в клетках рака шейки матки человека, специфическое влияние и лежащие в его основе механизмы FAM83A при раке шейки матки остаются неясными.

В этом исследовании мы описываем протоколы, участвующие в идентификации FAM83A в качестве гена-мишени опухоли при раке шейки матки, и используем небольшую интерферирующую РНК (миРНК) для нокдауна гена FAM83A в клетках HeLa и C33a . Для определения влияния на пролиферацию опухолевых клеток было проведено окрашивание 5-этинил-2′-дезоксиуридином (EdU), в то время как ранозаживление и анализ вставки пористой мембраны помогли оценить миграцию опухолевых клеток и способность к инвазии.

Для определения уровней белков, связанных с апоптозом, проводили вестерн-блоттинг, а для оценки изменений митохондриальной функции использовали окрашивание JC-1. Таким образом, мы сообщили, что FAM83A играет решающую роль в пролиферации, метастазировании и инвазии клеток при раке шейки матки. Через митохондриальную дисфункцию и апоптоз, ассоциированный с PI3K/AKT, FAM83A нокдаун сенсибилизировал клетки рака шейки матки к цисплатину (диаминдихлорплатине, DDP). Это исследование предоставляет новую мишень для рака шейки матки и, возможно, других видов рака, а также ориентир для разработки стратегий преодоления резистентности раковых клеток к определенным химиотерапевтическим препаратам.

Protocol

Исследование полностью соответствовало рекомендациям по публикациям, предоставленным TCGA (https://cancergenome.nih.gov/publications/publicationguidelines). См. Таблицу материалов для получения подробной информации, связанной со всеми материалами, реагентами и инструментами, используемыми в этом протокол…

Representative Results

Анализ базы данных TCGA и проверка ПЦР На основе анализа базы данных TCGA мы провели сравнительный анализ уровней экспрессии мРНК в 306 образцах клеток рака шейки матки и 13 образцах нормальных клеток для изучения дифференциальной ?…

Discussion

Исследование генов-мишеней опухоли имеет первостепенное значение как для профилактики, так и для лечения рака шейки матки. Понимание конкретных генов, которые играют значительную роль в развитии и прогрессировании рака шейки матки, дает ценную информацию о лежащих в основе молекулярн…

Materials

Cells and Medium Formulation
C33a	American Type Culture Collection
Hela	American Type Culture Collection
Modified medium			10% fetal bovine serum and + antibiotics (100 U/mL penicillin and 100 U/mL streptomycin)
Antibody Information
AKT	4691, Cell Signaling Technology Inc.		‘1:1,000
Bcl2	26593-1-AP, Proteintech Group, Inc		‘1:1,000
Caspase 3	19677-1-AP, Proteintech Group, Inc		‘1:2,000
cleaved-caspase3	abs132005; Absin Bioscience Inc.		‘1:1,000
Cytc	10993-1-AP; Proteintech Group		‘1:1,000
GAPDH	10494-1-AP, Proteintech Group, Inc.		‘1:8,000
mTOR	2983, Cell Signaling Technology Inc.		‘1:1,000
PI3K	4292, Cell Signaling Technology Inc		‘1:1,000
p-AKT	4060, Cell Signaling Technology Inc.		‘1:1,000
p-mTOR (Ser2448)	#5536, Cell Signaling Technology Inc.		‘1:1,000
p-PI3K p85 subunit	17366, Cell Signaling Technology Inc.		‘1:1,000
Secondary antibodies	GB23303, Servicebio		‘1:2,000
Materials
6-well plate	Corning, NPY
Alexa Fluor 555	Beyotime
BCA Protein assay kit	Beyotime, China		P0011
ChemiDoc XRS Imager System	BioRad
Enhanced chemiluminescence detection kit	Servicebio, Inc.,China		cat. no. G2014
Fluorescence microscope	Olympus Corporation, Tokyo, Japan
Hifair II 1st Strand cDNA Synthesis Super Mix	11123ES60, Yeasen Biotech o., Ltd., China
			Inverted microscope	Olympus, Tokyo, Japan;
Millicell transwell inserts	Millipore,Bedford, MA, USA
Mitochondrial membrane potential assay kit	Beyotime, China
PMSF	ST506, Beyotime Biotech, Jiangsu, China		#ST506
Real-time quantitative PCR instrument	Applied Biosystems, Thermo Fisher Scientific. China.
			RIPA Lysis Buffer	Beyotime Biotech, Jiangsu, China
TRIzol reagent	Invitrogen		15596026
TRIzol reagent	Takara Bio Inc., Otsu, Japan
Software
Image-Pro	plus 6.0