자궁경부암 세포 성장 및 시스플라틴 감수성에서의 역할을 검증하기 위한 FAM83A 의 녹다운
Summary
여기에서는 FAM83A 녹다운 절차를 보여줍니다. 자궁경부암 세포의 증식, 이동 및 침입에 대한 효과를 감지하기 위한 분석; 그리고 이 세포들이 시스플라틴에 감작됩니다. 이 연구는 자궁경부암에 대한 유망한 표적 유전자와 추가 약물 연구를 위한 참고 자료를 제공합니다.
Abstract
종양 표적 유전자의 탐색은 자궁경부암의 예방과 치료에 가장 중요합니다. 이 연구에서는 자궁경부암에서 종양 표적 유전자 FAM83A의 식별과 관련된 단계를 간략하게 설명합니다. 첫째, 여성에서 FAM83A의 발현과 예후의 중요성을 검증하기 위해 Cancer Genome Atlas 데이터 세트를 사용했습니다. 작은 간섭 RNA(siRNA)는 HeLa 및 C33a 세포에서 FAM83A 유전자의 녹다운에 사용되었습니다. 다음으로, 종양 세포의 증식 능력에 미치는 영향을 확인하기 위해 5-ethynyl-2′-deoxyuridine(EdU) 염색을 수행했습니다. 종양 세포 이동 및 침습 능력을 평가하기 위해 상처 치유 및 다공성 막 삽입 분석을 수행했습니다.
웨스턴 블로팅(Western blotting)은 세포사멸 관련 단백질 수준을 정량화하는 데 사용되었습니다. JC-1 염색은 미토콘드리아 기능 변화를 평가하기 위해 사용되었습니다. 또한, 시스플라틴(디아민디클로로플래티넘, DDP) 중재를 사용하여 표적 유전자의 치료 가능성을 평가했습니다. 유전자의 항암 특성을 추가로 검증하기 위해 유세포 분석 및 콜로니 형성 분석을 수행했습니다. 그 결과, FAM83A 녹다운은 자궁경부암 세포의 증식, 이동 및 침습을 억제하고 이 세포를 시스플라틴에 감작시키는 것으로 나타났습니다. 이러한 포괄적인 방법론은 FAM83A 를 종양 관련 표적 유전자로 총체적으로 검증하여 자궁경부암 예방 및 치료의 잠재적 치료 표적으로서의 가능성을 제시합니다.
Introduction
자궁경부암은 전 세계적으로 부인과 악성 종양의 주요 유형 중 하나이며 여성의 암 관련 사망률의 주요 원인이기 때문에 전 세계적인 관심사입니다1. 근치적 수술과 화학방사선 요법은 1차 단계에서 높은 완치율과 관련이 있습니다. 그러나 자궁경부암이 진행된 환자에서 전이성 질환이 발생한 환자의 치료 결과는 매우 좋지 않다2. 따라서 자궁경부암 세포의 이동과 침습의 기저에 있는 생물학적 메커니즘을 더 깊이 이해하고 이 질병의 예방 및 치료를 위한 잠재적인 치료 표적을 식별하는 것이 중요합니다.
암 진행에 관여하는 표적 유전자를 확인하고 그 발현이나 작용을 억제하는 방법을 찾는 것은 유망한 치료 옵션을 제시합니다. 이 연구에서 우리는 FAM83을 암 유발 유전자로 확인하고 C33a 및 HeLa 세포에 대한 억제 효과를 추가로 조사했습니다. FAM83 계열 종양유전자(FAM83A-H)는 인간 암에서 널리 보고되고 있다 3,4. 최근 FAM83A는 폐5암,유방 암,난소 암 7암,췌장 8암에서 상향 조절되는 것으로 보고되었으며, 이는 FAM83A가 종양 세포의 증식, 침습, 줄기세포 유사 형질 및 약물 내성을 촉진하여 암 진행에 중요한 역할을 한다는 것을 나타냅니다. 중요한 것은 FAM83A가 자궁경부 병변 진행 및 발암과 관련된 새로운 후보 유전자 중 하나로 확인되었다는 점이다9. 인간 자궁경부암 세포에서 FAM83A 발현이 증가한 것으로 확인되었음에도 불구하고, 자궁경부암에서 FAM83A의 구체적인 영향과 기전은 여전히 불분명하다.
이 연구에서는 자궁경부암에서 FAM83A를 종양 표적 유전자로 식별하는 데 관련된 프로토콜을 간략하게 설명하고 HeLa 및 C33a 세포에서 FAM83A 유전자의 녹다운을 위해 작은 간섭 RNA(siRNA)를 사용합니다. 종양 세포 증식에 미치는 영향을 확인하기 위해 5-Ethynyl-2′-deoxyuridine(EdU) 염색을 수행했으며, 상처 치유 및 다공성 막 삽입 분석은 종양 세포 이동 및 침습 능력을 평가하는 데 도움이 되었습니다.
세포사멸 관련 단백질의 수준을 측정하기 위해 웨스턴 블로팅을 수행하고, 미토콘드리아 기능 변화를 평가하기 위해 JC-1 염색을 사용했습니다. 따라서 FAM83A 가 자궁경부암의 세포 증식, 전이 및 침범에 중요한 역할을 한다고 보고했습니다. PI3K/AKT 경로 관련 미토콘드리아 기능 장애 및 세포사멸을 통해 FAM83A 녹다운은 자궁경부암 세포를 시스플라틴(디아민디클로로플래티넘, DDP)에 감작시켰습니다. 이 연구는 자궁경부암 및 기타 암에 대한 새로운 표적과 특정 화학 요법 약물에 대한 암세포의 내성을 극복하기 위한 전략 개발을 위한 참고 자료를 제공합니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
종양 표적 유전자의 조사는 자궁경부암의 예방과 치료에 가장 중요합니다. 자궁경부암의 발병과 진행에 중요한 역할을 하는 특정 유전자를 이해하면 질병의 근본적인 분자 메커니즘에 대한 귀중한 통찰력을 얻을 수 있습니다. 또한 이러한 표적 유전자를 식별하면 새로운 치료 전략 및 표적 치료법을 개발할 수 있습니다. 이 연구에서는 TCGA 데이터 세트 분석을 사용하여 FAM83A 를 표적 유전?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 작업은 Jingzhou Science and Technology Bureau Foundation(no. 2020HC06)의 지원을 받았습니다.
Materials
| Cells and Medium Formulation | |||
| C33a | American Type Culture Collection | ||
| Hela | American Type Culture Collection | ||
| Modified medium | 10% fetal bovine serum and + antibiotics (100 U/mL penicillin and 100 U/mL streptomycin) | ||
| Antibody Information | |||
| AKT | 4691, Cell Signaling Technology Inc. | ‘1:1,000 | |
| Bcl2 | 26593-1-AP, Proteintech Group, Inc | ‘1:1,000 | |
| Caspase 3 | 19677-1-AP, Proteintech Group, Inc | ‘1:2,000 | |
| cleaved-caspase3 | abs132005; Absin Bioscience Inc. | ‘1:1,000 | |
| Cytc | 10993-1-AP; Proteintech Group | ‘1:1,000 | |
| GAPDH | 10494-1-AP, Proteintech Group, Inc. | ‘1:8,000 | |
| mTOR | 2983, Cell Signaling Technology Inc. | ‘1:1,000 | |
| PI3K | 4292, Cell Signaling Technology Inc | ‘1:1,000 | |
| p-AKT | 4060, Cell Signaling Technology Inc. | ‘1:1,000 | |
| p-mTOR (Ser2448) | #5536, Cell Signaling Technology Inc. | ‘1:1,000 | |
| p-PI3K p85 subunit | 17366, Cell Signaling Technology Inc. | ‘1:1,000 | |
| Secondary antibodies | GB23303, Servicebio | ‘1:2,000 | |
| Materials | |||
| 6-well plate | Corning, NPY | ||
| Alexa Fluor 555 | Beyotime | ||
| BCA Protein assay kit | Beyotime, China | P0011 | |
| ChemiDoc XRS Imager System | BioRad | ||
| Enhanced chemiluminescence detection kit | Servicebio, Inc.,China | cat. no. G2014 | |
| Fluorescence microscope | Olympus Corporation, Tokyo, Japan | ||
| Hifair II 1st Strand cDNA Synthesis Super Mix | 11123ES60, Yeasen Biotech o., Ltd., China | ||
| Inverted microscope | Olympus, Tokyo, Japan; | ||
| Millicell transwell inserts | Millipore,Bedford, MA, USA | ||
| Mitochondrial membrane potential assay kit | Beyotime, China | ||
| PMSF | ST506, Beyotime Biotech, Jiangsu, China | #ST506 | |
| Real-time quantitative PCR instrument | Applied Biosystems, Thermo Fisher Scientific. China. | ||
| RIPA Lysis Buffer | Beyotime Biotech, Jiangsu, China | ||
| TRIzol reagent | Invitrogen | 15596026 | |
| TRIzol reagent | Takara Bio Inc., Otsu, Japan | ||
| Software | |||
| Image-Pro | plus 6.0 | ||
References
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