تحليل الجمجمة التشكل في الزرد عن طريق 4D متحد البؤر المجهري
Summary
الوقت الفاصل بين التصوير متحد البؤر هي تقنية قوية مفيدة لوصف التطور الجنيني. هنا، نحن تصف منهجية وتميز التشكل القحفي في البرية من نوع، وكذلك pdgfra، smad5، وSMO الأجنة متحولة.
Abstract
الوقت الفاصل بين التصوير هو الاسلوب الذي يسمح لمراقبة مباشرة لعملية التشكل، أو جيل من الشكل. بسبب درجة وضوحها البصرية وقابليته للتلاعب الجيني، أصبح الجنين الزرد كائن نموذج شعبية مع الذي لإجراء تحليل الوقت الفاصل بين التشكل في الأجنة الحية. التصوير متحد البؤر من جنين الزرد الحية يتطلب أن الأنسجة من الاهتمام هو المسمى باستمرار مع علامة فلوري، مثل التحوير أو صبغ حقن. يطالب العملية أن الجنين هو تخدير والذي عقد في مكان في مثل هذه الطريقة التي التنمية الصحية العائدات بشكل طبيعي. يجب أن يتم تعيين المعلمات من أجل التصوير لحساب نمو ثلاثي الأبعاد، وتحقيق التوازن بين مطالب حل الخلايا الفردية حين الحصول على لقطات سريعة من التنمية. نتائجنا تثبت القدرة على أداء على المدى الطويل في مجال التصوير المجراة من الأجنة الزرد المسمى مضان وللكشف عن السلوكيات الأنسجة المتنوعة فيقمة الجمجمة العصبية التي تسبب تشوهات القحفي. تأخر في النمو الناجمة عن التخدير وتركيب هي الحد الأدنى، والأجنة دون أن يمسهم سوء من قبل العملية. يمكن إرجاع الأجنة الوقت الفاصل بين تصوير والمتوسطة السائل وبعد ذلك تصويرها أو ثابتة في نقطة لاحقة في عملية التنمية. مع وفرة متزايدة من خطوط الزرد المعدلة وراثيا ورسم الخرائط مصير تتميز جيدا وتقنيات زرع، والتصوير أي نوع من الأنسجة المطلوب هو ممكن. على هذا النحو، والوقت الفاصل بين التصوير في الجسم الحي يجمع بقوة مع الأساليب الوراثية الزرد، بما في ذلك تحليل الأجنة متحولة وmicroinjected.
Introduction
التشكل القحفي معقدة عملية متعددة الخطوات التي تتطلب التفاعلات المنسقة بين أنواع خلايا متعددة. مشتق غالبية الهيكل العظمي القحفي من الخلايا العصبية قمة، وكثير منها يجب أن يهاجر من الظهرية الأنبوب العصبي في الهياكل عابرة يسمى الأقواس البلعومية 1. كما هو الحال مع العديد من الأنسجة، التشكل من الهيكل العظمي القحفي هو أكثر تعقيدا مما يمكن أن يكون مفهوما من قبل صور ثابتة الأجنة في نقاط محددة الوقت التنموية. على الرغم من أنها لأداء تستغرق وقتا طويلا، ويوفر في الجسم الحي الوقت الفاصل بين المجهري نظرة المستمر في الخلايا والأنسجة الجنين النامي. كل صورة في سلسلة الوقت الفاصل بين يقرض السياق إلى الآخرين، ويساعد تحرك المحقق نحو استنتاج سبب حدوث ظاهرة بدلا من استنتاج ما يحدث في ذلك الوقت.
في الجسم الحي التصوير هو بالتالي أداة قوية لنهج وصفي التجريبية لتفكيك مسارات التي توجه التشكل. ودانيو rerio الزرد هو نموذج الجيني شعبية من التطور الجنيني الفقاريات، وبشكل خاص مناسبة تماما لفي الجسم الحي التصوير من التشكل. الحديثة، وأساليب مريحة لنقل الجينات والتعديل الجيني تتقدم بسرعة عدد الأدوات المتاحة للباحثين الزرد. هذه الأدوات تحسين أساليب قوية بالفعل للتلاعب الجيني والمجهري. في الجسم الحي التصوير من النسيج تقريبا أي في أي سياق الوراثية المطلوب تقريبا هو اقرب الى الواقع من الخيال.
وتسترشد الحركات التخلق من الأقواس البلعومية بواسطة إشارات التفاعلات بين قمة العصبية وظهائر المجاورة، سواء الأديم الظاهر الأديم الباطن و. هناك العديد من الجزيئات يشير أعرب عنها ظهائر والتي هي ضرورية لدفع التشكل من عناصر الهيكل العظمي القحفي. بين هذه الجزيئات يشير، سونيك القنفذ (شش) هو و أهمية حاسمةأو تطوير القحفي 2-8. وأعرب عن شش كل من الأديم الظاهر الأديم الباطن الفم والبلعوم 2،6،9،10. التعبير عن شش في الأديم الباطن ينظم الحركات التخلق من الأقواس 10، الزخرفة من قمة العصبية داخل الأقواس 10، ونمو الهيكل العظمي القحفي 11.
BMP يشير أيضا أهمية حاسمة للتنمية القحفي 12، ويمكن تغيير التشكل من الأقواس البلعومية. BMP إشارات ينظم ظهري / بطني الزخرفة من قمة داخل الأقواس البلعومية 13،14. تعطل smad5 في الزرد يسبب تشوهات الحنك الشديد وفشل الغضاريف وميكل لتندمج بشكل مناسب في خط الوسط 15. بالإضافة إلى ذلك، عرض المسوخ أيضا تخفيضات والانصهار في العناصر الغضروف بطني، مع الثانية 2، 3 الثالثة، وأحيانا عناصر ال 4 البلعوم القوس تنصهر في خط الوسط 15. هذه اندماج توحي بقوة تلك BMP إشارات يوجه التشكل من هذه العناصر البلعوم.
PDGF إشارات ضرورية للتنمية القحفي، ولكن لديها أدوار معروفة في البلعوم القوس التشكل. كلا الماوس والمسوخ Pdgfra الزرد ديك عميقة clefting midfacial 16-18. على الأقل في الزرد ويرجع ذلك إلى فشل السليم الهجرة الخلية قمة العصبية 16 هذا clefting midfacial. تستمر الخلايا العصبية للتعبير عن قمة pdgfra بعد أن تكون قد دخلت الأقواس البلعومية. بالإضافة إلى ذلك، يتم التعبير بروابط PDGF بواسطة ظهائر الوجه وداخل الأقواس البلعومية 16،19،20، وبالتالي PDGF الإشارات ويمكن أيضا أن تلعب دورا في التشكل من الأقواس البلعومية التالية الهجرة. ومع ذلك، يحلل من التشكل من الأقواس البلعومية في المسوخ pdgfra لم يتم تنفيذها.
هنا، علينا أن نظهر في الجسم الحي المجهري متحد البؤر من pharyngulمرحلة-الزرد المعدلة وراثيا ووصف التشكل من الأقواس البلعومية خلال هذه الفترة. نحن كذلك إظهار السلوكيات الأنسجة التي تتأثر الطفرات التي تعطل BMP و PDGF، وشش مسارات الإشارات.
Protocol
Representative Results
Discussion
الوقت الفاصل بين المجهري متحد البؤر هو أداة قوية لتحليل التنمية. هنا، علينا أن نظهر فائدة الأسلوب في دراسة البلعوم القوس التشكل في الزرد التي هي متحولة لمسارات الإشارات الهامة باستخدام الخلايا المعدلة وراثيا التي تصف قمة العصبية. بالإضافة إلى مستوى الأنسجة التحليل?…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
نشكر ميليسا غريفين وجينا Rozacky لرعايتهم الأسماك الخبراء. الحركة الديمقراطية الشعبية وذلك بفضل EGN لكتابة المساعدة، والكرم، والصبر. وأيد هذا العمل من قبل المعاهد الوطنية للصحة / NIDCR R01DE020884 لJKE.
Materials
| 6 lb. test monofilament line | Cortland Line Company | SLB16 | |
| Agarose I | Amresco | 0710 | |
| Argon laser | LASOS Lasertechnik GmbH | LGN 3001 | |
| Calcium chloride | Sigma-Aldrich | C8106 | |
| Capillary tubing, 100 mm, 0.9 mm ID | FHC | 30-31-0 | |
| Clove oil | Hilltech Canada, Inc. | HB-102 | |
| High vacuum grease | Dow Corning | 2021846-0807 | |
| Isotemp dry-bath incubator | Fisher Scientific | 2050FS | |
| Laser scanning microscope | Carl Zeiss AG | LSM 710 | |
| Magnesium sulfate hexahydrate | Sigma-Aldrich | 230391 | |
| Microscope cover glass, 22×22-1 | Fisher Scientific | 12-542-B | |
| Microscope cover glass, 24×60-1 | Fisher Scientific | 12-545-M | |
| Potassium chloride | Fisher Scientific | M-11321 | |
| Potassium phosphate dibasic | Sigma-Aldrich | P3786 | |
| Sodium chloride | Fisher Scientific | M-11624 | |
| Sodium phosphate dibasic | Sigma-Aldrich | S7907 | |
| TempController 2000-2 | PeCon GmbH | ||
| Tricaine-S | Western Chemical, Inc. |
Referenzen
- Trainor, P. A., Melton, K. R., Manzanares, M. Origins and plasticity of neural crest cells and their roles in jaw and craniofacial evolution. Int. J. Dev. Biol. 47, 541-553 (2003).
- Eberhart, J. K., Swartz, M. E., Crump, J. G., Kimmel, C. B. Early Hedgehog signaling from neural to oral epithelium organizes anterior craniofacial development. Development. 133, 1069-1077 (2006).
- Wada, N., et al. Hedgehog signaling is required for cranial neural crest morphogenesis and chondrogenesis at the midline in the zebrafish skull. Development. 132, 3977-3988 (2005).
- Roessler, E., et al. Mutations in the human sonic hedgehog gene cause holoprosencephaly. Nat. Genet. 14, 357-360 (1996).
- Jeong, J., Mao, J., Tenzen, T., Kottmann, A. H., McMahon, A. P. Hedgehog signaling in the neural crest cells regulates the patterning and growth of facial primordia. Genes Dev. 18, 937-951 (2004).
- Hu, D., Marcucio, R. S. A SHH-responsive signaling center in the forebrain regulates craniofacial morphogenesis via the facial ectoderm. Development. 136, 107-116 (2009).
- Cordero, D., et al. Temporal perturbations in sonic hedgehog signaling elicit the spectrum of holoprosencephaly phenotypes. J. Clin. Invest. 114, 485-494 (2004).
- Westphal, H., Beachyr, P. A. Cyclopia and defective axial patterning in mice lacking Sonic hedgehog gene function. Nature. 383, 3 (1996).
- Moore-Scott, B. A., Manley, N. R. Differential expression of Sonic hedgehog along the anterior-posterior axis regulates patterning of pharyngeal pouch endoderm and pharyngeal endoderm-derived organs. Dev. Biol. 278, 323-335 (2005).
- Swartz, M. E., Nguyen, V., McCarthy, N. Q., Eberhart, J. K. Hh signaling regulates patterning and morphogenesis of the pharyngeal arch-derived skeleton. Dev. Biol. 369, 65-75 (2012).
- Balczerski, B., et al. Analysis of Sphingosine-1-phosphate signaling mutants reveals endodermal requirements for the growth but not dorsoventral patterning of jaw skeletal precursors. Dev. Biol. , (2011).
- Nie, X., Luukko, K., Kettunen, P. BMP signalling in craniofacial development. Int. J. Dev. Biol. 50, 511-521 (2006).
- Alexander, C., et al. Combinatorial roles for BMPs and Endothelin 1 in patterning the dorsal-ventral axis of the craniofacial skeleton. Development. 138, 5135-5146 (2011).
- Zuniga, E., Rippen, M., Alexander, C., Schilling, T. F., Crump, J. G. Gremlin 2 regulates distinct roles of BMP and Endothelin 1 signaling in dorsoventral patterning of the facial skeleton. Development. 138, 5147-5156 (2011).
- Swartz, M. E., Sheehan-Rooney, K., Dixon, M. J., Eberhart, J. K. Examination of a palatogenic gene program in zebrafish. Dev. Dyn. 240, 2204-2220 (2011).
- Eberhart, J. K., et al. MicroRNA Mirn140 modulates Pdgf signaling during palatogenesis. Nat. Genet. 40, 290-298 (2008).
- Soriano, P. The PDGF alpha receptor is required for neural crest cell development and for normal patterning of the somites. Development. 124, 2691-2700 (1997).
- Tallquist, M. D., Soriano, P. Cell autonomous requirement for PDGFRalpha in populations of cranial and cardiac neural crest cells. Development. 130, 507-518 (2003).
- Ho, L., Symes, K., Yordan, C., Gudas, L. J., Mercola, M. Localization of PDGF A and PDGFR alpha mRNA in Xenopus embryos suggests signalling from neural ectoderm and pharyngeal endoderm to neural crest cells. Mech. Dev. 48, 165-174 (1994).
- Liu, L., Korzh, V., Balasubramaniyan, N. V., Ekker, M., Ge, R. Platelet-derived growth factor A (pdgf-a) expression during zebrafish embryonic development. Dev. Genes Evol. 212, 298-301 (2002).
- Westerfield, M. . The Zebrafish Book; A guide for the laboratory use of zebrafish (Brachydanio rerio). , (1993).
- Sheehan-Rooney, K., Swartz, M. E., Lovely, C. B., Dixon, M. J., Eberhart, J. K. Bmp and Shh Signaling Mediate the Expression of satb2 in the Pharyngeal Arches. PloS one. 8, e59533 (2013).
- Varga, Z. M., et al. Zebrafish smoothened functions in ventral neural tube specification and axon tract formation. Development. 128, 3497-3509 (2001).
- Grush, J., Noakes, D. L. G., Moccia, R. D. The efficacy of clove oil as an anesthetic for the zebrafish, Danio rerio. 1, 46-53 (2004).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nat. Methods. 9, 676-682 (2012).
- Crump, J. G., Maves, L., Lawson, N. D., Weinstein, B. M., Kimmel, C. B. An essential role for Fgfs in endodermal pouch formation influences later craniofacial skeletal patterning. Development. 131, 5703-5716 (2004).
- Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F. Stages of embryonic development of the zebrafish. Dev. Dyn. 203, 253-310 (1995).
- Alexandre, P., Reugels, A. M., Barker, D., Blanc, E., Clarke, J. D. Neurons derive from the more apical daughter in asymmetric divisions in the zebrafish neural tube. Nat. Neurosci. 13, 673-679 (2010).
