Het analyseren Craniofacial Morphogenesis in zebravis behulp 4D confocale microscopie
Summary
Time-lapse confocale beeldvorming is een techniek nuttig voor het karakteriseren van embryonale ontwikkeling. Hier beschrijven we de methode karakteriseren craniofaciale morfogenese in wildtype en PDGFRA, Smad5 en SMO mutant embryo's.
Abstract
Time-lapse beeldvorming is een techniek waarmee de directe observatie van het proces van morfogenese of het genereren van vorm. Door hun optische helderheid en ontvankelijkheid voor genetische manipulatie, heeft de zebravis embryo uitgegroeid tot een populaire modelorganisme waarmee time-lapse analyse van morfogenese voeren in levende embryo's. Confocale beeldvorming van een levende zebravis embryo vereist dat een van belang zijnd weefsel aanhoudend is gemerkt met een fluorescerende marker, zoals een transgen of geïnjecteerd kleurstof. De werkwijze vereist dat het embryo wordt verdoofd en bewaard op zodanige wijze dat gezonde ontwikkeling normaal verloopt. Parameters voor de beeldvorming moet worden ingesteld om rekening te houden driedimensionale groei en aan de eisen van het oplossen van individuele cellen terwijl het krijgen van snelle snapshots van ontwikkeling in evenwicht te brengen. Onze resultaten tonen het vermogen om op lange termijn te voeren in vivo beeldvorming van fluorescentie gelabelde zebravis embryo en gevarieerde weefsel gedrag detecterende craniale neurale dat craniofaciale afwijkingen veroorzaken. Ontwikkelingsstoornissen vertragingen veroorzaakt door de anesthesie en montage zijn minimaal, en embryo's zijn ongedeerd door het proces. Time-lapse afgebeeld embryo's kunnen worden teruggestuurd naar vloeibaar medium en vervolgens afgebeeld of vastgesteld op latere punten in ontwikkeling. Met een toenemende overvloed van transgene zebravis lijnen en goed gekarakteriseerd lot mapping en transplantatie technieken beeldvorming elke gewenste weefsel mogelijk. Als zodanig, time-lapse in vivo beeldvorming combineert krachtig met zebravissen genetische methoden, waaronder analyses van mutant en gemicroinjecteerd embryo's.
Introduction
Craniofacial morfogenese is een complexe multi-step proces dat gecoördineerde interacties tussen verschillende celtypen vereist. De meeste craniofaciale skelet is afgeleid van neurale cellen, waarvan vele moeten migreren van de dorsale neurale buis in tijdelijke structuren genoemd pharynxbogen 1. Zoals met veel weefsels, morfogenese van het craniofaciale skelet is ingewikkelder dan kan worden begrepen door statische beelden van embryo op specifieke ontwikkelingsstoornissen tijdstippen. Hoewel het tijdrovend om uit te voeren, in vivo time-lapse microscopie wordt een continu blik op cellen en weefsels een ontwikkelend embryo. Elk beeld in een time-lapse serie leent context aan de anderen, en helpt een onderzoeker stap in de richting afleiden waarom een verschijnsel optreedt in plaats van af te leiden wat er gebeurt op dat moment.
In vivo beeldvorming is dus een krachtig instrument voor beschrijvende experimentele benaderingendeconstrueren de routes die morfogenese begeleiden. De zebravis Danio rerio is een populaire genetisch model van gewervelde embryonale ontwikkeling, en is bijzonder geschikt voor in vivo beeldvorming van morfogenese. Modern, worden geschikte methodes voor transgenese en genomische modificatie snel voortschrijdende het aantal tools beschikbaar om zebravis onderzoekers. Deze tools verbeteren reeds robuuste methoden voor genetische manipulatie en microscopie. In vivo beeldvorming van bijna elk weefsel in bijna elke gewenste genetische context is dichter bij de werkelijkheid dan de fantasie.
Morfogenetische bewegingen van de pharynxbogen worden geleid door signalering interacties tussen de neurale lijst en de aangrenzende epitheel, zowel ectoderm en endoderm. Er zijn tal van signaalmoleculen door de epitheel uitgesproken dat nodig is om de morfogenese van craniofaciale skelet elementen te rijden zijn. Onder deze signaalmoleculen, Sonic Hedgehog (Shh) is van cruciaal belang fof craniofaciale ontwikkeling 2-8. Shh wordt uitgedrukt door zowel de orale ectoderm en keelholte endoderm 2,6,9,10. De expressie van Shh in het endoderm regelt morfogenetische bewegingen van de bogen 10, het vormen van neurale binnen de bogen 10 en groei van het craniofaciale skelet 11.
Bmp signalering is ook van cruciaal belang voor craniofaciale ontwikkeling 12 en kunnen morfogenese van de pharynxbogen veranderen. BMP signalering regelt dorsale / ventrale patroonvorming van kuif binnen de pharynxbogen 13,14. Verstoring van Smad5 in zebravis veroorzaakt ernstige palatinale defecten en een falen van de Meckel's kraakbeen om adequaat te smelten bij de middellijn 15. Bovendien, de mutanten ook worden weergegeven verlagingen en smelten in het ventrale kraakbeen elementen, de 2e, 3e en 4e soms keelboog elementen gefuseerd aan de middellijn 15. Deze fusies suggereren sterk dat Bmp signalering leidt de morfogenese van deze pharyngeal elementen.
PDGF signalering is noodzakelijk voor craniofaciale ontwikkeling, maar heeft een onbekend rollen in keelboog morfogenese. Zowel de muis en zebravis PDGFRA mutanten hebben een diepgaande midfacial clefting 16-18. Tenminste in de zebravis dit midfacial clefting is te wijten aan een falen van de juiste neurale lijst cel migratie 16. Neurale cellen blijven PDGFRA uiten nadat ze de pharynxbogen hebt ingevoerd. Daarnaast worden Pdgf liganden uitgedrukt door gezichtsuitdrukkingen epitheel en in de pharynxbogen 16,19,20, dus Pdgf signalering kan ook een rol spelen bij morfogenese van de pharynxbogen volgende migratie. Echter, analyses van de morfogenese van het pharynxbogen in PDGFRA mutanten zijn niet uitgevoerd.
Hier laten we zien in vivo confocale microscopie van pharynguleen-fase transgene zebravis en beschrijven van de morfogenese van het pharynxbogen binnen deze periode. We tonen verder aan weefsel gedragingen die worden beïnvloed door mutaties die de BMP PDGF en Shh signaleringsroutes verstoren.
Protocol
Representative Results
Discussion
Time-lapse confocale microscopie is een krachtig hulpmiddel voor de analyse van ontwikkeling. Hier tonen we het nut van de methode in het bestuderen keelboog morfogenese in zebravis die mutant voor belangrijke signalerende wegen met behulp van een transgeen dat neurale lijst cellen etiketten zijn. In aanvulling op het weefsel niveau analyseert, time lapse analyses zijn ook van toepassing op analyses op een cellulair schaal 28. Veel gebruikte zebravis methoden kunnen eveneens in time-lapse microscopie experime…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wij danken Melissa Griffin en Jenna Rozacky voor hun deskundige vis zorg. PDM dank EGN voor het schrijven van hulp, vrijgevigheid, en geduld. Dit werk werd ondersteund door NIH / NIDCR R01DE020884 te JKE.
Materials
| 6 lb. test monofilament line | Cortland Line Company | SLB16 | |
| Agarose I | Amresco | 0710 | |
| Argon laser | LASOS Lasertechnik GmbH | LGN 3001 | |
| Calcium chloride | Sigma-Aldrich | C8106 | |
| Capillary tubing, 100 mm, 0.9 mm ID | FHC | 30-31-0 | |
| Clove oil | Hilltech Canada, Inc. | HB-102 | |
| High vacuum grease | Dow Corning | 2021846-0807 | |
| Isotemp dry-bath incubator | Fisher Scientific | 2050FS | |
| Laser scanning microscope | Carl Zeiss AG | LSM 710 | |
| Magnesium sulfate hexahydrate | Sigma-Aldrich | 230391 | |
| Microscope cover glass, 22×22-1 | Fisher Scientific | 12-542-B | |
| Microscope cover glass, 24×60-1 | Fisher Scientific | 12-545-M | |
| Potassium chloride | Fisher Scientific | M-11321 | |
| Potassium phosphate dibasic | Sigma-Aldrich | P3786 | |
| Sodium chloride | Fisher Scientific | M-11624 | |
| Sodium phosphate dibasic | Sigma-Aldrich | S7907 | |
| TempController 2000-2 | PeCon GmbH | ||
| Tricaine-S | Western Chemical, Inc. |
Referenzen
- Trainor, P. A., Melton, K. R., Manzanares, M. Origins and plasticity of neural crest cells and their roles in jaw and craniofacial evolution. Int. J. Dev. Biol. 47, 541-553 (2003).
- Eberhart, J. K., Swartz, M. E., Crump, J. G., Kimmel, C. B. Early Hedgehog signaling from neural to oral epithelium organizes anterior craniofacial development. Development. 133, 1069-1077 (2006).
- Wada, N., et al. Hedgehog signaling is required for cranial neural crest morphogenesis and chondrogenesis at the midline in the zebrafish skull. Development. 132, 3977-3988 (2005).
- Roessler, E., et al. Mutations in the human sonic hedgehog gene cause holoprosencephaly. Nat. Genet. 14, 357-360 (1996).
- Jeong, J., Mao, J., Tenzen, T., Kottmann, A. H., McMahon, A. P. Hedgehog signaling in the neural crest cells regulates the patterning and growth of facial primordia. Genes Dev. 18, 937-951 (2004).
- Hu, D., Marcucio, R. S. A SHH-responsive signaling center in the forebrain regulates craniofacial morphogenesis via the facial ectoderm. Development. 136, 107-116 (2009).
- Cordero, D., et al. Temporal perturbations in sonic hedgehog signaling elicit the spectrum of holoprosencephaly phenotypes. J. Clin. Invest. 114, 485-494 (2004).
- Westphal, H., Beachyr, P. A. Cyclopia and defective axial patterning in mice lacking Sonic hedgehog gene function. Nature. 383, 3 (1996).
- Moore-Scott, B. A., Manley, N. R. Differential expression of Sonic hedgehog along the anterior-posterior axis regulates patterning of pharyngeal pouch endoderm and pharyngeal endoderm-derived organs. Dev. Biol. 278, 323-335 (2005).
- Swartz, M. E., Nguyen, V., McCarthy, N. Q., Eberhart, J. K. Hh signaling regulates patterning and morphogenesis of the pharyngeal arch-derived skeleton. Dev. Biol. 369, 65-75 (2012).
- Balczerski, B., et al. Analysis of Sphingosine-1-phosphate signaling mutants reveals endodermal requirements for the growth but not dorsoventral patterning of jaw skeletal precursors. Dev. Biol. , (2011).
- Nie, X., Luukko, K., Kettunen, P. BMP signalling in craniofacial development. Int. J. Dev. Biol. 50, 511-521 (2006).
- Alexander, C., et al. Combinatorial roles for BMPs and Endothelin 1 in patterning the dorsal-ventral axis of the craniofacial skeleton. Development. 138, 5135-5146 (2011).
- Zuniga, E., Rippen, M., Alexander, C., Schilling, T. F., Crump, J. G. Gremlin 2 regulates distinct roles of BMP and Endothelin 1 signaling in dorsoventral patterning of the facial skeleton. Development. 138, 5147-5156 (2011).
- Swartz, M. E., Sheehan-Rooney, K., Dixon, M. J., Eberhart, J. K. Examination of a palatogenic gene program in zebrafish. Dev. Dyn. 240, 2204-2220 (2011).
- Eberhart, J. K., et al. MicroRNA Mirn140 modulates Pdgf signaling during palatogenesis. Nat. Genet. 40, 290-298 (2008).
- Soriano, P. The PDGF alpha receptor is required for neural crest cell development and for normal patterning of the somites. Development. 124, 2691-2700 (1997).
- Tallquist, M. D., Soriano, P. Cell autonomous requirement for PDGFRalpha in populations of cranial and cardiac neural crest cells. Development. 130, 507-518 (2003).
- Ho, L., Symes, K., Yordan, C., Gudas, L. J., Mercola, M. Localization of PDGF A and PDGFR alpha mRNA in Xenopus embryos suggests signalling from neural ectoderm and pharyngeal endoderm to neural crest cells. Mech. Dev. 48, 165-174 (1994).
- Liu, L., Korzh, V., Balasubramaniyan, N. V., Ekker, M., Ge, R. Platelet-derived growth factor A (pdgf-a) expression during zebrafish embryonic development. Dev. Genes Evol. 212, 298-301 (2002).
- Westerfield, M. . The Zebrafish Book; A guide for the laboratory use of zebrafish (Brachydanio rerio). , (1993).
- Sheehan-Rooney, K., Swartz, M. E., Lovely, C. B., Dixon, M. J., Eberhart, J. K. Bmp and Shh Signaling Mediate the Expression of satb2 in the Pharyngeal Arches. PloS one. 8, e59533 (2013).
- Varga, Z. M., et al. Zebrafish smoothened functions in ventral neural tube specification and axon tract formation. Development. 128, 3497-3509 (2001).
- Grush, J., Noakes, D. L. G., Moccia, R. D. The efficacy of clove oil as an anesthetic for the zebrafish, Danio rerio. 1, 46-53 (2004).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nat. Methods. 9, 676-682 (2012).
- Crump, J. G., Maves, L., Lawson, N. D., Weinstein, B. M., Kimmel, C. B. An essential role for Fgfs in endodermal pouch formation influences later craniofacial skeletal patterning. Development. 131, 5703-5716 (2004).
- Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F. Stages of embryonic development of the zebrafish. Dev. Dyn. 203, 253-310 (1995).
- Alexandre, P., Reugels, A. M., Barker, D., Blanc, E., Clarke, J. D. Neurons derive from the more apical daughter in asymmetric divisions in the zebrafish neural tube. Nat. Neurosci. 13, 673-679 (2010).
