Analizando Craneofacial en la morfogénesis de pez cebra Utilizando 4D Microscopía Confocal
Summary
Imagen confocal Time-lapse es una técnica de gran alcance útil para caracterizar el desarrollo embrionario. Aquí se describe la metodología y caracterizamos la morfogénesis craneofacial de tipo salvaje, así como PDGFRA, Smad5 y smo embriones mutantes.
Abstract
Proyección de imagen de lapso de tiempo es una técnica que permite la observación directa del proceso de morfogénesis, o la generación de la forma. Debido a su claridad óptica y la susceptibilidad a la manipulación genética, el embrión de pez cebra se ha convertido en un organismo modelo muy popular con el que se realiza un análisis cronológico de la morfogénesis en embriones vivos. De formación de imágenes confocal de un embrión de pez cebra en vivo requiere que un tejido de interés se persistentemente marcado con un marcador fluorescente, tal como un transgén o medio de contraste inyectado. El proceso exige que el embrión se anestesia y se mantiene en su lugar de tal manera que el desarrollo saludable continúa normalmente. Parámetros para la formación de imágenes se deben configurar para tener en cuenta para el crecimiento tridimensional y para equilibrar las exigencias de la solución de células individuales al obtener fotos instantáneas de desarrollo. Nuestros resultados demuestran la capacidad de realizar a largo plazo de imágenes in vivo de embriones de pez cebra marcados con fluorescencia y para detectar variadas conductas de tejido enla cresta neural craneal que causan anomalías craneofaciales. Retrasos en el desarrollo causados por la anestesia y el montaje son mínimos, y los embriones son sanos y salvos por el proceso. Embriones Time-lapse fotografiados pueden devolverse al medio líquido y posteriormente reflejados o se fijan en los puntos posteriores en el desarrollo. Con una abundancia cada vez mayor de líneas de pez cebra transgénico y suerte de cartografía bien caracterizado y técnicas de trasplante, las imágenes de cualquier tejido que se desea es posible. Como tal, time-lapse de imágenes in vivo combina fuerza con métodos genéticos de pez cebra, incluyendo los análisis de los embriones mutantes y microinyectados.
Introduction
Morfogénesis craneofacial es un proceso de varios pasos complejos que requiere la interacción coordinada entre múltiples tipos de células. La mayoría del esqueleto craneofacial se deriva de células de la cresta neural, muchos de los cuales deben migrar desde la dorsal del tubo neural en estructuras transitorias llamados arcos faríngeos 1. Al igual que con muchos tejidos, la morfogénesis del esqueleto craneofacial es más complicado que puede ser entendido por imágenes estáticas de embriones en puntos específicos de tiempo de desarrollo. A pesar de que es mucho tiempo para llevar a cabo, in vivo microscopía de lapso de tiempo proporciona una apariencia continua en las células y tejidos de un embrión en desarrollo. Cada imagen en una serie de lapso de tiempo le da contexto a los otros, y ayuda a un movimiento hacia el investigador deducir por qué se produce un fenómeno en lugar de deducir lo que está ocurriendo en ese momento.
Imágenes in vivo es por tanto una herramienta descriptiva poderosa para enfoques experimentales paradeconstruir las vías que guían la morfogénesis. El pez cebra Danio rerio es un modelo genético popular de desarrollo embrionario de los vertebrados, y es particularmente adecuada para formación de imágenes in vivo de la morfogénesis. Moderno, métodos convenientes para la transgénesis y la modificación genómica están avanzando rápidamente el número de herramientas disponibles para los investigadores de pez cebra. Estas herramientas mejoran los métodos ya firmes para la manipulación genética y la microscopía. Imágenes in vivo de casi cualquier tejido en casi cualquier contexto genética deseada se acerca más a la realidad que la fantasía.
Movimientos morfogenéticos de los arcos faríngeos se guían por señales interacciones entre la cresta neural y el epitelio adyacente, tanto ectodermo y endodermo. Hay numerosas moléculas de señalización expresadas por los epitelios que son necesarios para conducir la morfogénesis de los elementos esqueléticos craneofaciales. Entre estas moléculas de señalización, Sonic Hedgehog (Shh) es de importancia crítica fo el desarrollo craneofacial 2-8. Shh se expresa tanto por el ectodermo oral y faríngea endodermo 2,6,9,10. La expresión de Shh en el endodermo regula los movimientos morfogenéticos de los arcos 10, el patrón de la cresta neural dentro de los arcos 10, y el crecimiento del esqueleto craneofacial 11.
Bmp señalización también es de vital importancia para el desarrollo craneofacial 12 y puede alterar la morfogénesis de los arcos faríngeos. Bmp señalización regula dorsal / ventral del patrón de cresta dentro de los arcos faríngeos 13,14. La interrupción de Smad5 en el pez cebra provoca graves defectos palatinos y un fracaso de los cartílagos de Meckel fusionar adecuadamente en la línea media 15. Además, los mutantes también muestran reducciones y de fusión en los elementos de cartílago ventral, con la 2 ª, 3 ª, y a veces elementos de arco 4 ª faríngea fusionados en la línea media 15. Estas fusiones sugieren fuertemente que la señalización de BMP dirige la morfogénesis de estos elementos faríngeas.
Señalización de PDGF es necesario para el desarrollo craneofacial, pero tiene funciones desconocidas en arco faríngeo morfogénesis. Tanto el ratón y el pez cebra mutantes PDGFRA tienen profunda fisura del tercio medio facial 16-18. Al menos en el pez cebra esta hendidura mediofacial es debido a un fallo de la adecuada migración de células de la cresta neural 16. Células de la cresta neural siguen expresando PDGFRA después de que hayan entrado en los arcos faríngeos. Además, los ligandos de PDGF se expresan por los epitelios facial y dentro de los arcos faríngeos 16,19,20, por lo tanto la señalización de PDGF también podrían desempeñar un papel en la morfogénesis de los arcos faríngeos siguientes migración. Sin embargo, los análisis de la morfogénesis de los arcos faríngeos en mutantes PDGFRA no han sido realizados.
Aquí, nos demuestran en microscopía confocal in vivo de pharynguluna etapa de pez cebra transgénico y describir la morfogénesis de los arcos faríngeos dentro de este período. Además, demuestran comportamientos de tejido que se ven afectados por mutaciones que alteran la Bmp, PDGF, y las vías de señalización de Shh.
Protocol
Representative Results
Discussion
Time-lapse microscopía confocal es una poderosa herramienta para el análisis del desarrollo. Aquí, nos demuestran la utilidad del método en el estudio de la morfogénesis arco faríngeo en el pez cebra, que son mutantes para importantes vías de señalización que utilizan un transgénico que marca las células de la cresta neural. Además de los análisis a nivel de los tejidos, los análisis de lapso de tiempo también son aplicables a los análisis a escala celular 28. Muchos métodos de pez cebra ampl…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Damos las gracias a Melissa Griffin y Jenna Rozacky para su cuidado de los peces experto. PDM gracias EGN para escribir la asistencia, la generosidad y la paciencia. Este trabajo fue apoyado por el NIH / NIDCR R01DE020884 a JKE.
Materials
| 6 lb. test monofilament line | Cortland Line Company | SLB16 | |
| Agarose I | Amresco | 0710 | |
| Argon laser | LASOS Lasertechnik GmbH | LGN 3001 | |
| Calcium chloride | Sigma-Aldrich | C8106 | |
| Capillary tubing, 100 mm, 0.9 mm ID | FHC | 30-31-0 | |
| Clove oil | Hilltech Canada, Inc. | HB-102 | |
| High vacuum grease | Dow Corning | 2021846-0807 | |
| Isotemp dry-bath incubator | Fisher Scientific | 2050FS | |
| Laser scanning microscope | Carl Zeiss AG | LSM 710 | |
| Magnesium sulfate hexahydrate | Sigma-Aldrich | 230391 | |
| Microscope cover glass, 22×22-1 | Fisher Scientific | 12-542-B | |
| Microscope cover glass, 24×60-1 | Fisher Scientific | 12-545-M | |
| Potassium chloride | Fisher Scientific | M-11321 | |
| Potassium phosphate dibasic | Sigma-Aldrich | P3786 | |
| Sodium chloride | Fisher Scientific | M-11624 | |
| Sodium phosphate dibasic | Sigma-Aldrich | S7907 | |
| TempController 2000-2 | PeCon GmbH | ||
| Tricaine-S | Western Chemical, Inc. |
Referenzen
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