Analisando Craniofacial morfogênese em Zebrafish Usando 4D microscopia confocal
Summary
Time-lapse confocal de imagem é uma poderosa técnica útil para caracterizar o desenvolvimento embrionário. Aqui, descrevemos a metodologia e caracterizar morfogênese craniofacial no tipo selvagem, bem como PDGFRA, smad5, e SMO embriões mutantes.
Abstract
Imagiologia de lapso de tempo é uma técnica que permite a observação directa do processo de morfogénese, ou a geração de forma. Devido à sua claridade óptica e responsabilidade para com a manipulação genética, o embrião de peixe-zebra tornou-se um organismo modelo popular com a qual para realizar a análise de lapso de tempo de morfogênese em embriões vivos. Imagem confocal de um embrião do peixe-zebra vivos exige que um tecido de interesse é persistentemente marcado com um marcador fluorescente, tal como um transgene ou corante injectado. O processo exige que o embrião é anestesiado e mantido no lugar, de tal maneira que o desenvolvimento prossegue normalmente saudável. Parâmetros para a imagem deve ser ajustado para ter em conta o crescimento tridimensional e para equilibrar as exigências da resolução de células individuais ao obter fotos rápidas de desenvolvimento. Os nossos resultados demonstram a capacidade de executar a longo prazo in vivo de imagens de embriões de peixes-zebra marcados com fluorescência para detectar e comportamentos de tecidos em variadasda crista neural cranial que causam anomalias craniofaciais. Atrasos de desenvolvimento causados pela anestesia e montagem são mínimos, e os embriões são ileso pelo processo. Embriões temporizadoP fotografada pode ser devolvido ao meio líquido e subsequentemente visualizados ou fixado em pontos mais tarde no desenvolvimento. Com um aumento da abundância de linhas de peixes-zebra transgénicos e mapeamento de destino bem caracterizados e as técnicas de transplante, imagiologia qualquer tecido desejado é possível. Como tal, de lapso de tempo em imagem in vivo combina poderosamente com métodos genéticos peixe-zebra, incluindo análises de embriões mutantes e microinjetados.
Introduction
Morfogênese craniofacial é um processo multi-passo complexo que requer interações coordenadas entre vários tipos de células. A maior parte do esqueleto craniofacial é derivada a partir de células da crista neural, muitas das quais devem migrar a partir do tubo neural dorsal em estruturas transientes chamados arcos faringe 1. Tal como acontece com muitos tecidos, morfogênese do esqueleto craniofacial é mais complicado do que pode ser entendido por imagens estáticas de embriões em pontos específicos de tempo de desenvolvimento. Embora seja para realizar demorado, in vivo, a microscopia de lapso de tempo proporciona uma aparência contínua em células e tecidos de um embrião em desenvolvimento. Cada imagem em uma série de lapso de tempo dá contexto para os outros, e ajuda a um movimento em direção investigador deduzir por que um fenômeno ocorre, em vez de deduzir o que está ocorrendo naquele momento.
Na imagem in vivo é, portanto, uma poderosa ferramenta descritiva de abordagens experimentais paradesconstruir os caminhos que guiam morfogênese. O Danio rerio peixe-zebra é um modelo genético popular de desenvolvimento embrionário dos vertebrados, e é particularmente bem adaptado para imagiologia in vivo de morfogénese. Modern, métodos convenientes para transgenia e genômica modificação estão avançando rapidamente o número de ferramentas disponíveis para pesquisadores peixe-zebra. Estas ferramentas de melhorar os métodos já robustos para manipulação genética e microscopia. Imagem in vivo de praticamente qualquer tecido em quase qualquer contexto genético desejado é mais próximo da realidade do que a fantasia.
Movimentos morfogenéticos dos arcos faríngeos são guiados por sinalização interações entre a crista neural e do epitélio adjacente, tanto ectoderma e endoderma. Existem inúmeras moléculas sinalizadoras expressas pelo epitélio que são necessários para accionar a morfogénese dos elementos esqueléticos craniofaciais. Entre essas moléculas sinalizadoras, Sonic Hedgehog (Shh) é extremamente importante fou desenvolvimento craniofacial 2-8. Shh é expressa tanto pelo ectoderma oral e faringe endoderme 2,6,9,10. A expressão de Shh em endoderme regula movimentos morfogenéticas dos arcos 10, padronização de crista neural dentro dos arcos 10, e o crescimento do esqueleto craniofacial 11.
Bmp sinalização também é extremamente importante para o desenvolvimento craniofacial 12 e pode alterar a morfogênese dos arcos faríngeos. Sinalização Bmp regula dorsal / ventral padronização de crista dentro dos arcos faríngeos 13,14. Rompimento de smad5 em zebrafish provoca graves defeitos palatais e um fracasso das cartilagens de Meckel para fundir de forma adequada na linha média 15. Além disso, os mutantes também exibem reduções e fusão dos elementos de cartilagem ventrais, com o 2 o, 3 o, e, por vezes, os elementos do arco 4 º faringe fundidos na linha média 15. Estas fusões sugerem fortemente que a sinalização BMP dirige a morfogênese destes elementos da faringe.
Sinalização PDGF é necessário para o desenvolvimento craniofacial, mas tem papéis desconhecidos em arco faríngeo morfogênese. Ambos rato e mutantes PDGFRA peixe-zebra tem profunda clefting terço médio da face 16-18. Pelo menos, no peixe-zebra este clefting média facial é devido a uma falha de migração de células da crista neural apropriado 16. Células da crista neural continuam a expressar PDGFRA depois de terem entrado os arcos faríngeos. Além disso, os ligandos de PDGF são expressos por epitélios facial e dentro dos arcos da faringe 16,19,20, assim sinalização PDGF pode também desempenhar um papel importante na morfogénese dos arcos da faringe após a migração. No entanto, as análises da morfogênese dos arcos faríngeos em mutantes PDGFRA não foram realizadas.
Aqui, nós demonstramos em microscopia confocal in vivo de pharyngulum estágio zebrafish transgênicos e descrever a morfogênese dos arcos faríngeos dentro deste período. Demonstramos mais comportamentos de tecido que são afetados por mutações que perturbam a BMP, PDGF, e Shh vias de sinalização.
Protocol
Representative Results
Discussion
Microscopia confocal Time-lapse é uma ferramenta poderosa para a análise do desenvolvimento. Aqui, nós demonstramos a utilidade do método no estudo da faringe arco morfogênese no peixe-zebra, que são mutantes por vias de sinalização importantes usando um transgênico que rotula células da crista neural. Além do nível de tecido análises, análises de lapso de tempo também são aplicáveis para análises de uma escala celular 28. Muitos métodos de peixe-zebra amplamente utilizados também po…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Agradecemos Melissa Griffin e Jenna Rozacky para seu especialista em cuidados de peixe. PDM graças EGN para escrever assistência, generosidade e paciência. Este trabalho foi financiado pelo NIH / NIDCR R01DE020884 para JKE.
Materials
| 6 lb. test monofilament line | Cortland Line Company | SLB16 | |
| Agarose I | Amresco | 0710 | |
| Argon laser | LASOS Lasertechnik GmbH | LGN 3001 | |
| Calcium chloride | Sigma-Aldrich | C8106 | |
| Capillary tubing, 100 mm, 0.9 mm ID | FHC | 30-31-0 | |
| Clove oil | Hilltech Canada, Inc. | HB-102 | |
| High vacuum grease | Dow Corning | 2021846-0807 | |
| Isotemp dry-bath incubator | Fisher Scientific | 2050FS | |
| Laser scanning microscope | Carl Zeiss AG | LSM 710 | |
| Magnesium sulfate hexahydrate | Sigma-Aldrich | 230391 | |
| Microscope cover glass, 22×22-1 | Fisher Scientific | 12-542-B | |
| Microscope cover glass, 24×60-1 | Fisher Scientific | 12-545-M | |
| Potassium chloride | Fisher Scientific | M-11321 | |
| Potassium phosphate dibasic | Sigma-Aldrich | P3786 | |
| Sodium chloride | Fisher Scientific | M-11624 | |
| Sodium phosphate dibasic | Sigma-Aldrich | S7907 | |
| TempController 2000-2 | PeCon GmbH | ||
| Tricaine-S | Western Chemical, Inc. |
Referenzen
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