Analizzando craniofacciale morfogenesi in Zebrafish Uso 4D Microscopia confocale
Summary
Time-lapse imaging confocale è una tecnica potente utile per caratterizzare sviluppo embrionale. Qui, descriviamo la metodologia e caratterizzare morfogenesi craniofacciale wild-type, così come PDGFRA, smad5, e SMO embrioni mutanti.
Abstract
Time-lapse imaging è una tecnica che permette l'osservazione diretta del processo di morfogenesi, o la generazione di forma. Grazie alla loro chiarezza e la riconducibilità alla manipolazione genetica ottica, l'embrione zebrafish è diventato un organismo modello popolare con cui eseguire l'analisi time-lapse della morfogenesi in embrioni viventi. Confocale di un embrione zebrafish vivo richiede che un tessuto di interesse è persistentemente marcata con un marcatore fluorescente, quale un transgene o colorante iniettato. Il processo richiede che l'embrione è anestetizzato e tenuto in posizione in modo tale che lo sviluppo sano procede normalmente. Parametri per l'imaging devono essere impostati per spiegare la crescita tridimensionale e di bilanciare le esigenze di risolvere singole cellule mentre ottenere rapidi snapshot di sviluppo. I nostri risultati dimostrano la capacità di eseguire a lungo termine imaging in vivo di embrioni di zebrafish fluorescenza etichettati e per rilevare vari comportamenti dei tessuti incresta neurale cranica che causano anomalie cranio-facciali. Ritardi nello sviluppo causati da anestesia e montaggio sono minime, e gli embrioni sono illesi dal processo. Embrioni Time-lapse impressi possono essere restituiti a mezzo liquido e successivamente ripreso o fissati ai punti successivi dello sviluppo. Con l'abbondanza crescente di linee di zebrafish transgenici e mappatura destino ben caratterizzato e tecniche di trapianto, l'imaging qualsiasi tessuto desiderato è possibile. Come tale, time-lapse imaging in vivo coniuga potentemente con metodi genetici zebrafish, comprese le analisi di embrioni mutanti e microiniettati.
Introduction
Morfogenesi craniofacciale è un complesso processo multi-step che richiede interazioni coordinate tra più tipi di cellule. La maggior parte dello scheletro craniofacciale è derivato da cellule della cresta neurale, molti dei quali devono migrare dal tubo neurale dorsale in strutture transitori chiamati archi faringei 1. Come in molti tessuti, morfogenesi dello scheletro craniofacciale è più complicato che può essere compreso da immagini statiche di embrioni in punti temporali specifici dello sviluppo. Sebbene per funzionare richiede tempo, in vivo microscopia time-lapse fornisce un aspetto continuo a cellule e tessuti di un embrione di sviluppo. Ogni immagine in una serie di time-lapse presta contesto agli altri, e aiuta una mossa investigatore verso dedurre perché si verifica un fenomeno anziché dedurlo ciò che sta avvenendo in quel momento.
Imaging in vivo è quindi un potente strumento descrittivo per approcci sperimentalidecostruire i percorsi che guidano la morfogenesi. Il Danio rerio zebrafish è un modello genetico popolare di sviluppo embrionale dei vertebrati, ed è particolarmente adatto per l'imaging in vivo della morfogenesi. Moderno, comodi metodi di transgenesi e la modifica genomica stanno rapidamente avanzando il numero di strumenti a disposizione dei ricercatori di zebrafish. Questi strumenti permettono di migliorare metodi già robuste per la manipolazione genetica e la microscopia. Immagini in vivo di quasi tutti i tessuti in quasi ogni contesto genetico desiderato è più vicino alla realtà di quanto la fantasia.
Movimenti morfogenetici degli archi faringei sono guidati da segnalare interazioni tra la cresta neurale e gli epiteli adiacente, sia ectoderma e endoderma. Numerose sono le molecole di segnalazione espresse dal epiteli che sono necessarie per guidare la morfogenesi di elementi scheletrici craniofacciali. Tra queste molecole di segnalazione, Sonic Hedgehog (Shh), è di fondamentale importanza fo sviluppo craniofacciale 2-8. Shh è espresso sia dalla ectoderma cavo orale e faringe endoderma 2,6,9,10. L'espressione di Shh nel endoderma regola i movimenti morfogenetici degli archi 10, patterning di cresta neurale all'interno degli archi 10, e la crescita dello scheletro craniofacciale 11.
Segnalazione Bmp è anche di fondamentale importanza per lo sviluppo craniofacciale 12 e può alterare la morfogenesi degli archi faringei. Segnalazione Bmp regola dorsale / ventrale patterning di cresta all'interno degli archi faringei 13,14. Turbativa di smad5 in zebrafish causa gravi difetti palatali e un fallimento della cartilagini del Meckel di fondere in modo appropriato sulla linea mediana 15. Inoltre, i mutanti mostrano anche riduzioni e fusione negli elementi cartilagine ventrale, con il 2 °, 3 °, e talvolta elementi arco 4 ° faringea fusi sulla linea mediana 15. Queste fusioni suggeriscono fortemente che la segnalazione Bmp dirige la morfogenesi di questi elementi faringee.
Segnalazione PDGF è necessario per lo sviluppo cranio-facciale, ma ha ruoli sconosciuti in faringeo arch morfogenesi. Sia il mouse e zebrafish mutanti PDGFRA hanno profonda clefting mediofacciale 16-18. Almeno in zebrafish questo clefting mediofacciale è dovuta ad un imperfetto della migrazione delle cellule della cresta neurale 16. Cellule della cresta neurale continuano ad esprimere PDGFRA dopo essere entrati gli archi faringei. Inoltre, leganti PDGF sono espresse da epiteli facciale e all'interno degli archi faringei 16,19,20, così segnalazione PDGF potrebbero anche svolgere un ruolo nella morfogenesi degli archi faringei seguenti migrazione. Tuttavia, le analisi della morfogenesi degli archi faringei in mutanti PDGFRA non sono stati eseguiti.
Qui, dimostriamo in vivo microscopia confocale di pharynguluna fase zebrafish transgenico e descrivere la morfogenesi degli archi faringei entro questo periodo. Dimostriamo inoltre i comportamenti dei tessuti che sono affetti da mutazioni che interrompono la Bmp, PDGF, e vie di segnalazione Shh.
Protocol
Representative Results
Discussion
Time-lapse microscopia confocale è un potente strumento per l'analisi dello sviluppo. Qui, dimostriamo l'utilità del metodo nello studio della faringe arco morfogenesi in zebrafish che sono mutante per vie di segnalazione importanti utilizzando un transgenici che le etichette cellule della cresta neurale. Oltre al livello del tessuto analisi, analisi lasso di tempo sono applicabili ad analisi su scala cellulare 28 anche. Molti metodi di zebrafish ampiamente utilizzati possono anche essere incorporat…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ringraziamo Melissa Griffin e Jenna Rozacky per la loro esperta cura dei pesci. PDM grazie EGN per la scrittura di assistenza, generosità e pazienza. Questo lavoro è stato sostenuto da NIH / NIDCR R01DE020884 a JKE.
Materials
| 6 lb. test monofilament line | Cortland Line Company | SLB16 | |
| Agarose I | Amresco | 0710 | |
| Argon laser | LASOS Lasertechnik GmbH | LGN 3001 | |
| Calcium chloride | Sigma-Aldrich | C8106 | |
| Capillary tubing, 100 mm, 0.9 mm ID | FHC | 30-31-0 | |
| Clove oil | Hilltech Canada, Inc. | HB-102 | |
| High vacuum grease | Dow Corning | 2021846-0807 | |
| Isotemp dry-bath incubator | Fisher Scientific | 2050FS | |
| Laser scanning microscope | Carl Zeiss AG | LSM 710 | |
| Magnesium sulfate hexahydrate | Sigma-Aldrich | 230391 | |
| Microscope cover glass, 22×22-1 | Fisher Scientific | 12-542-B | |
| Microscope cover glass, 24×60-1 | Fisher Scientific | 12-545-M | |
| Potassium chloride | Fisher Scientific | M-11321 | |
| Potassium phosphate dibasic | Sigma-Aldrich | P3786 | |
| Sodium chloride | Fisher Scientific | M-11624 | |
| Sodium phosphate dibasic | Sigma-Aldrich | S7907 | |
| TempController 2000-2 | PeCon GmbH | ||
| Tricaine-S | Western Chemical, Inc. |
Referenzen
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