Stem Cell-like<em> Xenopus</em> Embryonnaires explants à étudier les caractéristiques du développement précoce Neural<em> In Vitro</em> Et<em> In Vivo</em
Summary
In Xenopus embryos, cells from the roof of the blastocoel are pluripotent and can be programmed to generate various tissues. Here, we describe protocols to use amphibian blastocoel roof explants as an assay system to investigate key in vivo and in vitro features of early neural development.
Abstract
Understanding the genetic programs underlying neural development is an important goal of developmental and stem cell biology. In the amphibian blastula, cells from the roof of the blastocoel are pluripotent. These cells can be isolated, and programmed to generate various tissues through manipulation of genes expression or induction by morphogens. In this manuscript protocols are described for the use of Xenopus laevis blastocoel roof explants as an assay system to investigate key in vivo and in vitro features of early neural development. These protocols allow the investigation of fate acquisition, cell migration behaviors, and cell autonomous and non-autonomous properties. The blastocoel roof explants can be cultured in a serum-free defined medium and grafted into host embryos. This transplantation into an embryo allows the investigation of the long-term lineage commitment, the inductive properties, and the behavior of transplanted cells in vivo. These assays can be exploited to investigate molecular mechanisms, cellular processes and gene regulatory networks underlying neural development. In the context of regenerative medicine, these assays provide a means to generate neural-derived cell types in vitro that could be used in drug screening.
Introduction
Le système nerveux des vertébrés émerge de la plaque neurale comme une couche homogène de cellules neuro-épithéliales. Comprendre comment les programmes de développement sont induites, codés, et établis au cours de la régionalisation de la plaque neurale est, à l'heure actuelle, un objectif majeur en biologie du développement. Par rapport à d'autres systèmes, l'embryon de Xenopus prêtent expérimentalement est un modèle de choix pour l'analyse des étapes précoces de développement neural 1,2. Il est facile d'obtenir un grand nombre d'embryons, et le développement externe donne accès aux toutes premières étapes de la neurulation 3. De nombreux outils sont disponibles pour manipuler expérimentalement Xenopus laevis (X. laevis) de développement embryonnaire. Micro-injection d'ARNm ou morpholinos (MO), y compris OM inductibles, ainsi que des outils biochimiques et pharmacologiques, permet gain de fonction (GOF) et la perte de fonction (LOF) et altération spécifique des voies de signalisation 4,5 contrôlé. Le blastocoel toit ectoderme, situé autour du pôle animal d'une blastula, ou une gastrula embryon très tôt, et désigné comme le «Cap animale» (AC), est une source de cellules pluripotentes qui peut être programmé par la manipulation de l'expression génique avant explants préparation. Dans ce manuscrit sont des protocoles détaillés pour utiliser X. explants laevis AC pour tester in vitro et in vivo mécanismes moléculaires et cellulaires de développement processus neuronal sous-jacent.
Une technique est présentée, permettant l'observation fine de profils d'expression génique dans un tube neural têtard de Xenopus, une étape préliminaire dans l'identification de la détermination du destin des indices. Considérant que l'observation des tissus plates-montée est couramment utilisé dans l'étude des embryons de poulet 6, il n'a pas été correctement décrit dans Xenopus. Manipulation de l'expression génique par injection d'ARNm synthétique ou MO dans les blastomères de 2 ou 4 embryons au stade de la cellule permet la programmation de l'AC4 explants. Par exemple inhibition de la voie Bone Morphogenetic Protein (BMP) par l'expression du facteur anti-BMP noggine, donne une identité à des cellules neurales AC 3. Le protocole est détaillé pour la réalisation d'une exposition locale et contrôlée dans le temps des explants AC aux signaux extrinsèques par contact direct avec une perle de résine échangeuse d'anions. Enfin, une technique est décrite pour tester des fonctionnalités de développement de progéniteurs neuronaux in vivo par la transplantation d'explants mixte préparé à partir de cellules distinctes programmé dissociées et ré-associés.
L'embryon de la grenouille est un modèle puissant pour étudier le développement neural vertébrés tôt. Combinant manipulation de l'expression génique pour explantation des cultures in vitro fournit des renseignements importants dans l'étude de neuroépithélium régionalisation, la prolifération et la morphogenèse 7-12. La programmation des explants AC permis le développement d'un cœur fonctionnel ex vivo 13,14. L'utilisationexplant de greffage 15 a conduit à l'identification de l'interrupteur de transcription induisant minimal du programme de différenciation de la crête neurale 16. Le limitans zona intrathalamica (ZLI) est un centre de signalisation qui sécrète sonic hedgehog (Shh) pour contrôler la croissance et la régionalisation du cerveau antérieur caudale. Lorsque permanence exposé à Shh, les cellules neuro co-exprimant le facteur trois gènes de transcription – Barh-like Homeobox-2 (barhl2), orthodenticle-2 (otx2) et Iroquois-3 (irx3) – acquièrent deux caractéristiques du compartiment ZLI: la compétence pour shh exprimer, et la capacité à séparer à partir de cellules de la plaque neurale antérieure. En tant que système modèle, l'induction d'une destinée neuro-épithéliales dans des cellules ZLI sera présenté 8.
Ces protocoles visent à fournir, et des outils efficaces simples et bon marché pour les biologistes du développement et d'autres chercheurs pour explorer le mec fondamentalehanisms de comportements clés de cellules neurales. Ces protocoles sont très polyvalents et permettent à l'enquête sur une large gamme de extrinsèques et intrinsèques détermination signaux neuronaux. Il permet long terme dans l'analyse in vivo de l'engagement de la lignée de neurones, les interactions inductives et les comportements cellulaires.
Protocol
Representative Results
Discussion
Le développement neuronal est orchestré par une interaction complexe entre les programmes de développement et les signaux cellulaires des tissus environnants (Avis à 3,31,32). Nous décrivons ici un ensemble de protocoles qui peut être utilisé dans X. laevis embryons à explorer facteurs extrinsèques et intrinsèques impliquées dans la détermination du destin de neurones et de la morphogenèse neuronale in vitro et in vivo. Ces protocoles peuvent être utilisés te…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The author thanks Hugo Juraver-Geslin, Marion Wassef and Anne Hélène Monsoro-Burq for their help and advice, and the Animal Facility of the Institut Curie. The author thanks Paul Johnson for his editing work on the manuscript. This work was supported by the Centre National de la Recherche Scientifique (CNRS UMR8197, INSERM U1024) and by grants from the “Association pour la Recherche sur le Cancer” (ARC 4972 and ARC 5115; FRC DOC20120605233 and LABEX Memolife) and the Fondation Pierre Gilles de Gennes (FPGG0039).
Materials
| Paraformaldehyde | VWR | 20909.290 | Toxic |
| anion exchange resin beads | Biorad | 140- 1231 | |
| Bovine Serum Albumin | SIGMA | A-7888 | For culture of animal cappH 7.6 |
| Gentamycine | GIBCO | 15751-045 | antibiotic |
| Bovine Serum Albumin | SIGMA | A7906 | for bead preparation |
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