Stammzell-ähnlichen<em> Xenopus</em> Embryonale Explantate bis Früh Neurale Entwicklungs- Eigenschaften Studieren<em> In-vitro-</em> Und<em> In-vivo-</em
Summary
In Xenopus embryos, cells from the roof of the blastocoel are pluripotent and can be programmed to generate various tissues. Here, we describe protocols to use amphibian blastocoel roof explants as an assay system to investigate key in vivo and in vitro features of early neural development.
Abstract
Understanding the genetic programs underlying neural development is an important goal of developmental and stem cell biology. In the amphibian blastula, cells from the roof of the blastocoel are pluripotent. These cells can be isolated, and programmed to generate various tissues through manipulation of genes expression or induction by morphogens. In this manuscript protocols are described for the use of Xenopus laevis blastocoel roof explants as an assay system to investigate key in vivo and in vitro features of early neural development. These protocols allow the investigation of fate acquisition, cell migration behaviors, and cell autonomous and non-autonomous properties. The blastocoel roof explants can be cultured in a serum-free defined medium and grafted into host embryos. This transplantation into an embryo allows the investigation of the long-term lineage commitment, the inductive properties, and the behavior of transplanted cells in vivo. These assays can be exploited to investigate molecular mechanisms, cellular processes and gene regulatory networks underlying neural development. In the context of regenerative medicine, these assays provide a means to generate neural-derived cell types in vitro that could be used in drug screening.
Introduction
Wirbelnervensystem geht aus dem neuronalen Platte als homogene Schicht von Neuroepithelzellen. Zu verstehen, wie Entwicklungsprogramme werden induziert, codiert, und gründete während Regionalisierung der Neuralplatte ist gegenwärtig eines der Hauptziele in der Entwicklungsbiologie. Im Vergleich zu anderen Systemen ist die experimentell zugänglich Xenopus Embryo ein Modell der Wahl für die Analyse von frühen Schritte der neuralen Entwicklung 1,2. Es ist leicht, eine große Zahl von Embryonen zu erhalten, und externe Entwicklung ermöglicht den Zugang zu den ersten Schritten der Neurulation 3. Viele Werkzeuge zur Verfügung, um experimentell zu manipulieren Xenopus laevis (X. laevis) Embryonalentwicklung. Mikroinjektion von mRNAs oder Morpholinos (MO), einschließlich der induzierbaren MOs zusammen mit biochemischen und pharmakologischen Werkzeugen ermöglicht kontrollierte gain of function (GOF) und Funktionsverlust (LOF) und spezifische Änderung der Signalwege 4,5. Der blastocoel Dach Ektoderm, um das Tier Pol einer Blastula oder einem sehr frühen Gastrula Embryo entfernt und bezeichnet als "animal cap" (AC), eine Quelle von pluripotenten Zellen, die durch Manipulation der Genexpression vor programmiert werden kann, Explantaten Vorbereitung. In diesem Manuskript sind ausführliche Protokolle zu verwenden X. laevis AC Explantaten in vitro und in vivo molekularen und zellulären Prozesse zugrunde liegenden neuralen Entwicklung zu testen.
Es wird eine Technik vorgestellt, wobei eine feine Beobachtung von Genexpressionsmustern in einer Xenopus Kaulquappe Neuralrohr, einen vorläufigen Schritt bei der Identifizierung von Schicksal Bestimmung Cues. Während die Beobachtung der Flachgewebe angebracht wird allgemein bei der Untersuchung von Hühnerembryonen 6 verwendet wird, ist nicht korrekt in Xenopus beschrieben. Manipulation der Genexpression durch Einspritzen von Kunst mRNA oder MO in die Blastomeren von 2 oder 4 Zellen Embryonen ermöglicht die Programmierung ACExplantaten 4. B. Inhibierung des Bone Morphogenetic Protein (BMP) Weg durch die Expression des anti-BMP Faktor Noggin, gibt ein neuronales Identität AC Zellen 3. Das Protokoll wird zum Ausführen von lokalen und zeitgesteuerte Belichtung AC Explantate auf extrinsische Cues durch direkten Kontakt mit einem Anionenaustauscherharz Wulst beschrieben. Schließlich wird eine Technik zur Prüfung von Entwicklungs Merkmale der neuralen Vorläuferzellen in vivo durch Transplantation von gemischten Explantaten aus verschiedenen programmierten Zellen dissoziiert und Wieder assoziiert beschrieben hergestellt.
Der Frosch Embryo ist ein leistungsfähiges Modell zu frühen Wirbeltiere neuralen Entwicklung zu studieren. Die Kombination Manipulation der Genexpression in vitro-Kulturen Explantation liefert wichtige Informationen in der Studie von Neuroepithel Regionalisierung, Proliferation und Morphogenese 7-12. Die Programmierung der AC Explantate gestattet Entwicklung eines funktionellen Herz ex vivo 13,14. Die VerwendungExplantatmedium Pfropfen 15 führte zur Identifizierung des minimalen Transkriptionsschalter Induzieren der Neuralleiste Differenzierungsprogramms 16. Die Zona limitans intrathalamica (ZLI) ist ein Signalisierungszentrum, das Sonic Hedgehog (Shh), um das Wachstum und die Regionalisierung der Schwanzvorderhirn steuern absondert. Wenn kontinuierlich auf Shh ausgesetzt Neuroepithelzellen Koexpression der drei Genen für Transkriptionsfaktoren – Barh artigen homeobox-2 (barhl2), orthodenticle-2 (OTX2) und Iroquois-3 (irx3) – zu erwerben zwei Eigenschaften der ZLI Fach: die Kompetenz, shh auszudrücken, und die Fähigkeit, von anterior Neuralplatte Zellen zu trennen. Als Modellsystem wird die Induktion einer ZLI Schicksal in Neuroepithelzellen präsentiert 8 werden.
Diese Protokolle zielen darauf ab, einfach, billig und effiziente Werkzeuge für die Entwicklungsbiologen und andere Forscher, die fundamentale mec erkundenhanisms von Schlüssel neuronalen Zell Verhaltensweisen. Diese Protokolle sind sehr vielseitig und ermöglichen die Untersuchung einer großen Palette von extrinsischen und intrinsischen neuronalen Bestimmung Cues. Es ermöglicht langfristig in vivo Analyse neuronaler Abstammung Engagement, induktive Wechselwirkungen und Zell Verhaltensweisen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Neuralen Entwicklung wird durch ein komplexes Wechselspiel zwischen zellulären Entwicklungsprogrammen und Signale von dem umgebenden Gewebe (Bewertet in 3,31,32) instrumentiert. Eine Reihe von Protokollen, die in X verwendet werden kann Hier beschreiben wir laevis Embryonen extrinsischen und intrinsischen Faktoren in neuronalen Schicksal Entschlossenheit und neuronalen Morphogenese in vitro und in vivo beteiligt zu erkunden. Diese Protokolle können als solche auf…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The author thanks Hugo Juraver-Geslin, Marion Wassef and Anne Hélène Monsoro-Burq for their help and advice, and the Animal Facility of the Institut Curie. The author thanks Paul Johnson for his editing work on the manuscript. This work was supported by the Centre National de la Recherche Scientifique (CNRS UMR8197, INSERM U1024) and by grants from the “Association pour la Recherche sur le Cancer” (ARC 4972 and ARC 5115; FRC DOC20120605233 and LABEX Memolife) and the Fondation Pierre Gilles de Gennes (FPGG0039).
Materials
| Paraformaldehyde | VWR | 20909.290 | Toxic |
| anion exchange resin beads | Biorad | 140- 1231 | |
| Bovine Serum Albumin | SIGMA | A-7888 | For culture of animal cappH 7.6 |
| Gentamycine | GIBCO | 15751-045 | antibiotic |
| Bovine Serum Albumin | SIGMA | A7906 | for bead preparation |
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