幹細胞様<em>アフリカツメガエル</em>胚外植片を早期神経発達の特徴を研究するために<em>インビトロ</em>と<em>インビボ</em
Summary
In Xenopus embryos, cells from the roof of the blastocoel are pluripotent and can be programmed to generate various tissues. Here, we describe protocols to use amphibian blastocoel roof explants as an assay system to investigate key in vivo and in vitro features of early neural development.
Abstract
Understanding the genetic programs underlying neural development is an important goal of developmental and stem cell biology. In the amphibian blastula, cells from the roof of the blastocoel are pluripotent. These cells can be isolated, and programmed to generate various tissues through manipulation of genes expression or induction by morphogens. In this manuscript protocols are described for the use of Xenopus laevis blastocoel roof explants as an assay system to investigate key in vivo and in vitro features of early neural development. These protocols allow the investigation of fate acquisition, cell migration behaviors, and cell autonomous and non-autonomous properties. The blastocoel roof explants can be cultured in a serum-free defined medium and grafted into host embryos. This transplantation into an embryo allows the investigation of the long-term lineage commitment, the inductive properties, and the behavior of transplanted cells in vivo. These assays can be exploited to investigate molecular mechanisms, cellular processes and gene regulatory networks underlying neural development. In the context of regenerative medicine, these assays provide a means to generate neural-derived cell types in vitro that could be used in drug screening.
Introduction
脊椎動物の神経系は神経上皮細胞の均質層として神経板から出てきます。発生プログラムは、神経板の地域化の際に、誘導された符号化され、確立されている方法を理解することは、現時点では、発生生物学の主要な目標です。他のシステムと比較して、実験的に影響を受けやすいアフリカツメガエル胚は神経発達1,2の初期段階を分析するための選択のモデルです。これは、胚を大量に得ることが容易であり、外部の開発は神経胚形成3の非常に最初のステップへのアクセスを提供します。多くのツールは、実験的にアフリカツメガエル （ アフリカツメガエル）胚発生を操作するために利用可能です。一緒に生化学的および薬理学的ツールで誘導MOを含めたmRNAまたはモルフォリノ（MO）のマイクロインジェクション、関数（GOF）および機能喪失（LOF）および経路4,5シグナリングの特定の改変の制御ゲインができます。 BLA胞胚の動物極の周りに配置stocoel屋根外胚葉、または非常に初期原腸胚、および「アニマルキャップ」（AC）とも呼ばれる前に遺伝子発現を操作することによってプログラムすることができる多能性細胞の供給源であります準備を外植片。この原稿ではXを使用するための詳細なプロトコルは、 ツメガエル交流植片は、in vitroおよびin vivo分子機構および細胞プロセス基盤となる神経の発達にテストします。
技術は、 アフリカツメガエルのオタマジャクシの神経管における遺伝子発現パターンの微細な観察 を可能にする、運命の決意キューの同定における予備段階を提示しています。フラットマウント組織の観察は、一般にニワトリ胚6の研究で使用されるが、それは適切にアフリカツメガエルに記載されていません。 2または4細胞期胚の割球に合成mRNAまたはMOを注入することにより、遺伝子発現の操作は、ACのプログラミングを可能にします外植4。抗BMP要因ノギンの発現による骨形成タンパク質（BMP）経路の例を阻害するために、AC細胞3に神経アイデンティティを与えます。プロトコルは、陰イオン交換樹脂ビーズとの直接接触を介して、外因性の合図にAC外植片の局所及び露光時間制御を行うために詳述されています。最後に、技術は、解離および再会合プログラムの異なる細胞から調製した混合植片の移植により、インビボで神経前駆細胞の発達の機能をテストするために記載されています。
カエルの胚は、初期の脊椎動物の神経発達を研究するための強力なモデルです。 体外培養で外植片に遺伝子発現の操作を組み合わせることにより、神経上皮の地域化、増殖、および形態形成7-12の研究に重要な情報を提供しています。交流外植片のプログラミングは 、ex vivo 13,14の機能の心臓の開発を可能にしました。使用15を移植植片の神経堤分化プログラム16を誘導する最小の転写スイッチの同定につながりました。 透明帯境界のintrathalamica（ZLI）は尾側前脳の成長と地域化を制御するために、ソニックヘッジホッグ（Shhのを）分泌シグナルセンターです。連続のShhにさらされると、3転写因子の遺伝子を共発現神経上皮細胞- BARH様ホメオボックス2（barhl2）、orthodenticle-2（OTX2）とイロコイ-3（irx3 は） – ZLI室の二つの特徴を取得する：能力へSHH発現し、前方神経板の細胞から分離する能力。モデル系として、神経上皮細胞へのZLIの運命の誘導は8に提示されます。
これらのプロトコルは、基本的なMECを探索するために発達生物学者や他の研究者のための単純な、安く、効率的なツールを提供することを目指してキー神経細胞の挙動のhanisms。これらのプロトコルは、非常に汎用性であり、外因性および内因性神経決意合図の大規模な範囲の調査を可能にします。これは、神経系統のコミットメント、誘導性相互作用および細胞行動の生体分析に長期を可能にします。
Protocol
Representative Results
Discussion
神経発生は（3,31,32に投稿）周囲の組織からの細胞の発生プログラムと信号間の複雑な相互作用によって編成されます。ここでは、Xで使用することができるプロトコルのセットを記述し外因性およびin vitroおよびin vivoでの神経運命の決意と神経形態形成に関与する内因性の要因を探るために胚をアフリカツメガエル 。これらのプロトコルは、Xでその?…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The author thanks Hugo Juraver-Geslin, Marion Wassef and Anne Hélène Monsoro-Burq for their help and advice, and the Animal Facility of the Institut Curie. The author thanks Paul Johnson for his editing work on the manuscript. This work was supported by the Centre National de la Recherche Scientifique (CNRS UMR8197, INSERM U1024) and by grants from the “Association pour la Recherche sur le Cancer” (ARC 4972 and ARC 5115; FRC DOC20120605233 and LABEX Memolife) and the Fondation Pierre Gilles de Gennes (FPGG0039).
Materials
| Paraformaldehyde | VWR | 20909.290 | Toxic |
| anion exchange resin beads | Biorad | 140- 1231 | |
| Bovine Serum Albumin | SIGMA | A-7888 | For culture of animal cappH 7.6 |
| Gentamycine | GIBCO | 15751-045 | antibiotic |
| Bovine Serum Albumin | SIGMA | A7906 | for bead preparation |
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