Kök hücre benzeri<em> Xenopus</em> Embriyonik Eksplantlarındaki Erken Nöral Gelişim Özellikleri Okuyacak<em> İn Vitro</em> Ve<em> İn Vivo</em
Summary
In Xenopus embryos, cells from the roof of the blastocoel are pluripotent and can be programmed to generate various tissues. Here, we describe protocols to use amphibian blastocoel roof explants as an assay system to investigate key in vivo and in vitro features of early neural development.
Abstract
Understanding the genetic programs underlying neural development is an important goal of developmental and stem cell biology. In the amphibian blastula, cells from the roof of the blastocoel are pluripotent. These cells can be isolated, and programmed to generate various tissues through manipulation of genes expression or induction by morphogens. In this manuscript protocols are described for the use of Xenopus laevis blastocoel roof explants as an assay system to investigate key in vivo and in vitro features of early neural development. These protocols allow the investigation of fate acquisition, cell migration behaviors, and cell autonomous and non-autonomous properties. The blastocoel roof explants can be cultured in a serum-free defined medium and grafted into host embryos. This transplantation into an embryo allows the investigation of the long-term lineage commitment, the inductive properties, and the behavior of transplanted cells in vivo. These assays can be exploited to investigate molecular mechanisms, cellular processes and gene regulatory networks underlying neural development. In the context of regenerative medicine, these assays provide a means to generate neural-derived cell types in vitro that could be used in drug screening.
Introduction
Omurgalı sinir sistemi nöroepitelyal homojen bir hücreler katmanı olarak nöral plaka ortaya çıkar. Gelişimsel programlar nöral plaka bölgeselleşme sırasında, uyarılan kodlanmış, ve kurulan nasıl anlamak, şu anda, gelişim biyolojisi önemli bir hedeftir. Diğer sistemlere göre, deneysel müsait Xenopus embriyo sinir gelişim 1,2 erken adımları analiz için tercih edilen bir modeldir. Bu embriyoların çok sayıda elde etmek kolaydır ve dış gelişme nörülasyon 3 ilk adımlar erişim sağlar. Birçok araç deneysel Xenopus laevis (X. laevis) embriyonik gelişim işlemek için kullanılabilir. Mikro enjeksiyon birlikte biyokimyasal ve farmakolojik araçlar ile indüklenebilir MOS dahil mRNA veya morpholinos (MO), bir, fonksiyon kazanç (GOF) ve fonksiyon (LOF) kaybı ve yolları 4,5 sinyal belirli değişiklik kontrollü verir. Blastocoel çatı ektoderm, bir blastulanın veya çok erken gastrula embriyo hayvan kutup etrafında yer alan ve "Hayvan Cap '(AC) olarak adlandırılır, gen ekspresyonunun önce manipülasyonu ile programlanabilir pluripotent hücreler kaynağıdır hazırlık eksplant. Bu yazıda X. kullanmak için ayrıntılı protokoller laevis AC eksplantları vitro ve in vivo moleküler mekanizmalar ve hücresel süreçleri altta yatan nöral gelişim test etmek.
Bir teknik Xenopus iribaş nöral tüp içinde gen ekspresyonu ince gözlem, kader tayini ipuçları belirlenmesinde bir ön adımı izin sunulmuştur. Düz monte dokuların gözlenmesi yaygın piliç embriyoları 6 çalışmada kullanılan Oysa, düzgün Xenopus tarif edilmemiştir. 2 veya 4 hücreli dönem embriyoların blastomer içine sentetik mRNA veya MO enjekte ederek gen ifadesinin Manipülasyon AC programlanmasına olanak tanır4 eksplant. Anti-BMP faktörü Noggin sentezlenmesiyle Kemik Morfogenetik Proteini (BMP) yolunun, örneğin inhibisyonu için, AC hücreleri 3 için bir sinir kimlik vermektedir. Protokol bir anyon değiştirme reçinesi boncuk ile doğrudan temas yoluyla dışsal uyaranlara AC eksplant yerel ve zaman kontrollü pozlama gerçekleştirmek için ayrıntılı. Son olarak bir teknik ayrılmış ve yeniden ilişkili programlanan farklı hücrelerden hazırlanan karışık eksplant nakli in vivo sinir progenitörlerin gelişim özelliklerini test etmek için bir işlem açıklanmaktadır.
Kurbağa embriyo erken omurgalı nöral gelişimini incelemek için güçlü bir modeldir. Gen ifadesinin manipülasyonu birleştiren in vitro kültürleri eksplantasyona için neuroepithelium bölgeselleşme, çoğalması ve morfojenezinin 7-12 çalışmada önemli bilgiler sağlar. AC eksplant programlama ex vivo 13,14 fonksiyonel kalp gelişimini izin verdi. Kullanımaşılama eksplant 15 nöral tepe farklılaşma programı 16 indükleyici az transkripsiyonel anahtarın tanımlamasına yol açmıştır. Zona limitans intrathalamica (ZLI) kaudal ön beyin gelişimini ve bölgeselleşme kontrol sonik kirpi (Sus) salgılar bir sinyal merkezidir. Sürekli Shh maruz kaldığında, üç transkripsiyon faktör genleri coexpressing nöroepitelyal hücreler – barH benzeri homeobox-2 (barhl2), orthodenticle-2 (otx2) ve Iroquois-3 (irx3) – ZLI bölmenin iki özelliklerini kazanmak: yeterliğinin şşş ifade ve ön nöral plak hücrelerden ayırmak yeteneği. Bir model sistem olarak, nöroepitelyal hücrelere bir ZLI kaderin indüksiyonu 8 sunulacaktır.
Bu protokoller temel mec keşfetmek için gelişimsel biyologlar ve diğer araştırmacılar için basit, ucuz ve verimli araçlar sağlamayı amaçlıyorAnahtar nöral hücre davranışları hanisms. Bu protokoller çok yönlü ve dışsal ve içsel nöral belirleme ipuçları geniş bir ürün yelpazesi soruşturma izin verir. Bu sinir soy bağlılığı, endüktif etkileşimleri ve hücre davranışlarının in vivo analizlerde uzun vadeli izin verir.
Protocol
Representative Results
Discussion
Nöral gelişim (3,31,32 yılında yorum) çevre dokulardan hücresel gelişim programları ve sinyaller arasındaki karmaşık bir etkileşim tarafından orkestra edildiği. Burada X kullanılabilecek protokoller kümesini tarif dışsal ve sinirsel kader tayini ve in vitro ve in vivo nöral morfogenez katılan içsel faktörlerin keşfetmek için embriyolar laevis. Bu protokoller, X'te gibi kullanılabilir tropicalis embriyolar, ancak X. tropical…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The author thanks Hugo Juraver-Geslin, Marion Wassef and Anne Hélène Monsoro-Burq for their help and advice, and the Animal Facility of the Institut Curie. The author thanks Paul Johnson for his editing work on the manuscript. This work was supported by the Centre National de la Recherche Scientifique (CNRS UMR8197, INSERM U1024) and by grants from the “Association pour la Recherche sur le Cancer” (ARC 4972 and ARC 5115; FRC DOC20120605233 and LABEX Memolife) and the Fondation Pierre Gilles de Gennes (FPGG0039).
Materials
| Paraformaldehyde | VWR | 20909.290 | Toxic |
| anion exchange resin beads | Biorad | 140- 1231 | |
| Bovine Serum Albumin | SIGMA | A-7888 | For culture of animal cappH 7.6 |
| Gentamycine | GIBCO | 15751-045 | antibiotic |
| Bovine Serum Albumin | SIGMA | A7906 | for bead preparation |
Referenzen
- Nieuwkoop, P. D. IIB, Pattern formation in the developing central nervous system (CNS) of the amphibians and birds (English). Proceedings of the Koninklijke Nederlandse Akademie van Wetenschappen. 94, 121-127 (1991).
- Nieuwkoop, P. D. The neural induction process; its morphogenetic aspects. Int J Dev Biol. 43, 615-623 (1999).
- Harland, R. Neural induction. Curr Opin Genet Dev. 10, 357-362 (2000).
- Sive, H. L., Grainger, R. M., Harland, R. M. . Early development of Xenopus laevis : a laboratory manual. , (2000).
- Hoppler, S., Vize, P. D., Hoppler, S., Vize, P. D. . Xenopus protocols : post-genomic approaches. , (2012).
- Franklin Hughes, W., La Velle, A. The effects of early tectal lesions on development in the retinal gonglion cell layer of chick embryos. J Comp Neurol. 163, 265-283 (1975).
- Theveneau, E., Mayor, R. Beads on the run: beads as alternative tools for chemotaxis assays. Methods Mol Biol. 769, 449-460 (2011).
- Juraver-Geslin, H. A., Gomez-Skarmeta, J. L., Durand, B. C. The conserved barH-like homeobox-2 gene barhl2 acts downstream of orthodentricle-2 and together with iroquois-3 in establishment of the caudal forebrain signaling center induced by Sonic Hedgehog. Dev Biol. 396, 107-120 (2014).
- Green, J. B., New, H. V., Smith, J. C. Responses of embryonic Xenopus cells to activin and FGF are separated by multiple dose thresholds and correspond to distinct axes of the mesoderm. Cell. 71, 731-739 (1992).
- Wallingford, J. B., Ewald, A. J., Harland, R. M., Fraser, S. E. Calcium signaling during convergent extension in Xenopus. Curr Biol. 11, 652-661 (2001).
- Kiecker, C., Niehrs, C. A morphogen gradient of Wnt/beta-catenin signalling regulates anteroposterior neural patterning in Xenopus. DEVELOPMENT. 128, 4189-4201 (2001).
- Wilson, P. A., Hemmati-Brivanlou, A. Induction of epidermis and inhibition of neural fate by Bmp-4. Nature. 376, 331-333 (1995).
- Afouda, B. A., Hoppler, S. Xenopus explants as an experimental model system for studying heart development. Trends in cardiovascular medicine. 19, 220-226 (2009).
- Afouda, B. A. Stem-cell-like embryonic explants to study cardiac development. Methods Mol Biol. 917, 515-523 (2012).
- Milet, C., Monsoro-Burq, A. H. Dissection of Xenopus laevis neural crest for in vitro explant culture or in vivo transplantation. Journal of visualized experiments: JoVE. , (2014).
- Milet, C., Maczkowiak, F., Roche, D. D., Monsoro-Burq, A. H. Pax3 and Zic1 drive induction and differentiation of multipotent, migratory, and functional neural crest in Xenopus embryos. Proc Natl Acad Sci U S A. 110, 5528-5533 (2013).
- Nieuwkoop, P. D., Faber, J., Nieuwkoop, P. D., Faber, J. . Normal table of Xenopus laevis (Daudin): a systematical and chronological survey of the development from the fertilized egg till the end of metamorphosis. , (1994).
- Harland, R. M. In situ hybridization: an improved whole-mount method for Xenopus embryos. Methods Cell Biol. 36, 685-695 (1991).
- Turner, D. L., Weintraub, H. Expression of achaete-scute homolog 3 in Xenopus embryos converts ectodermal cells to a neural fate. Genes Dev. 8, 1434-1447 (1994).
- Sive, H. L., Grainger, R. M., Harland, R. M. Removing the Vitelline Membrane from Xenopus laevis Embryos. CSH protocols. , (2007).
- Sive, H. L., Grainger, R. M., Harland, R. M. Animal Cap Isolation from Xenopus laevis. CSH protocols. , (2007).
- Sive, H. L., Grainger, R. M., Harland, R. M. Embryo dissection and micromanipulation tools. CSH protocols. , (2007).
- Wilson, S. W., Houart, C. Review: Early Steps in the Development of the Forebrain. Developmental Cell. 6, 167-181 (2004).
- Juraver-Geslin, H. A., Durand, B. C. Early development of the neural plate: new roles for apoptosis and for one of its main effectors caspase-3. Genesis. 53, 203-224 (2015).
- Heasman, J. Patterning the early Xenopus embryo. Development. 133, 1205-1217 (2006).
- Rubenstein, J. L., Martinez, S., Shimamura, K., Puelles, L. The embryonic vertebrate forebrain: the prosomeric model. Science. 266, 578-580 (1994).
- Puelles, L., Rubenstein, J. L. R. Forebrain gene expression domains and the evolving prosomeric model. Trends in Neurosciences. 26, 469-476 (2003).
- Martinez-Ferre, A., Martinez, S. Molecular regionalization of the diencephalon. Frontiers In Neuroscience. 6, 73-73 (2012).
- Scholpp, S., Lumsden, A. Review: Building a bridal chamber: development of the thalamus. Trends in Neurosciences. 33, 373-380 (2010).
- Coffman, C., Harris, W., Kintner, C. Xotch, the Xenopus homolog of Drosophila notch. Science. 249, 1438-1441 (1990).
- Pera, E. M., Acosta, H., Gouignard, N., Climent, M., Arregi, I. Active signals, gradient formation and regional specificity in neural induction. Exp Cell Res. 321, 25-31 (2014).
- Stern, C. D. Neural induction: old problem, new findings, yet more questions. Development. 132, 2007-2021 (2005).
- Juraver-Geslin, H. A., Ausseil, J. J., Wassef, M., Durand, B. C. Barhl2 limits growth of the diencephalic primordium through Caspase3 inhibition of beta-catenin activation. Proc Natl Acad Sci U S A. 108, 2288-2293 (2011).
- Sive, H. L., Grainger, R. M., Harland, R. M. Dissociation and Reaggregation of Xenopus laevis Animal Caps. CSH protocols. , (2007).
- Harland, R. M., Grainger, R. M. Xenopus research: metamorphosed by genetics and genomics. Trends Genet. 27, 507-515 (2011).
- Beccari, L., Marco-Ferreres, R., Bovolenta, P. The logic of gene regulatory networks in early vertebrate forebrain patterning. Mech Dev. 130, 95-111 (2013).
- Pani, A. M., et al. Ancient deuterostome origins of vertebrate brain signalling centres. Nature. 483, 289-294 (2012).
- Holland, L. Z., et al. Evolution of bilaterian central nervous systems: a single origin?. Evodevo. 4, 27 (2013).
- Pratt, K. G., Khakhalin, A. S. Modeling human neurodevelopmental disorders in the Xenopus tadpole: from mechanisms to therapeutic targets. Disease models & mechanisms. 6, 1057-1065 (2013).
- Sasai, Y., Ogushi, M., Nagase, T., Ando, S. Bridging the gap from frog research to human therapy: a tale of neural differentiation in Xenopus animal caps and human pluripotent cells. Development, growth & differentiation. 50, s47-s55 (2008).
