Стволовых клеток, как<em> Xenopus</em> Эмбриональные эксплантов для изучения раннего развития, особенности нейронных<em> In Vitro</em> И<em> В Vivo</em
Summary
In Xenopus embryos, cells from the roof of the blastocoel are pluripotent and can be programmed to generate various tissues. Here, we describe protocols to use amphibian blastocoel roof explants as an assay system to investigate key in vivo and in vitro features of early neural development.
Abstract
Understanding the genetic programs underlying neural development is an important goal of developmental and stem cell biology. In the amphibian blastula, cells from the roof of the blastocoel are pluripotent. These cells can be isolated, and programmed to generate various tissues through manipulation of genes expression or induction by morphogens. In this manuscript protocols are described for the use of Xenopus laevis blastocoel roof explants as an assay system to investigate key in vivo and in vitro features of early neural development. These protocols allow the investigation of fate acquisition, cell migration behaviors, and cell autonomous and non-autonomous properties. The blastocoel roof explants can be cultured in a serum-free defined medium and grafted into host embryos. This transplantation into an embryo allows the investigation of the long-term lineage commitment, the inductive properties, and the behavior of transplanted cells in vivo. These assays can be exploited to investigate molecular mechanisms, cellular processes and gene regulatory networks underlying neural development. In the context of regenerative medicine, these assays provide a means to generate neural-derived cell types in vitro that could be used in drug screening.
Introduction
Позвоночных нервная система выходит из нервной пластинки в виде однородного слоя нейроэпителиальных клеток. Понимание того, как программы развития индуцируется, кодируется, и установили во регионализации нервной пластинки, в настоящее время, одной из основных целей в биологии развития. По сравнению с другими системами, экспериментально поддаются Xenopus эмбрионов является модель выбора для анализа ранних стадиях нервной 1,2 развития. Это легко получить большое число эмбрионов, и внешнего развития дает доступ к самым первым шагом нейруляции 3. Многие инструменты доступны экспериментально манипулировать Xenopus Laevis (Х. Laevis) эмбрионального развития. Микро-инъекции мРНК или Morpholinos (МО), в том числе индуцируемых МО, вместе с биохимическими и фармакологическими средствами, позволяет контролируется усиление функции (GOF) и потерю функции (LOF) и конкретное изменение в пути 4,5 сигнализации. Дву-stocoel крыши эктодермы, расположенный вокруг животного полюса бластулы или очень ранней гаструлы эмбриона, и упоминается как "Animal предел" (AC), является источником плюрипотентных клеток, которые могут быть запрограммированы манипуляции экспрессии генов до экспланты подготовку. В этой рукописи подробные протоколы используют X. Laevis AC эксплантов, чтобы проверить в пробирке и в естественных молекулярных механизмов и клеточных процессов основной развития нервной системы.
Техника представлена, что позволяет прекрасный наблюдение шаблонов экспрессии генов в Xenopus головастиков нервной трубки, предварительный шаг в идентификации определения судьбы киев. В то время как наблюдение плоских монтажа тканей обычно используется в исследовании эмбрионов кур 6, она не была должным образом описаны в Xenopus. Манипуляция экспрессии генов путем введения синтетического мРНК или МО в бластомеры 2 или 4 стадии клеток эмбрионов позволяет программировать ACэкспланты 4. Например ингибирования костного морфогенетического белка (BMP) пути экспрессией анти-фактора Noggin BMP, дает нейронной идентичность переменного клеток 3. Протокол подробно для выполнения локального и управление временем экспозиции переменного тока с внешними эксплантов сигналы с помощью непосредственного контакта с анионообменной смолой шарик. Наконец методика описана для тестирования особенностей развития нейронных клеток-предшественников в естественных трансплантацией смешанных эксплантатов из различных приготовленных запрограммирован клеток диссоциированных и повторно связанных.
Лягушка эмбрион мощная модель для изучения раннего развития нервной системы позвоночных. Сочетание манипуляции экспрессии генов в эксплантата культур в пробирке дает важную информацию в изучении нейроэпителия регионализации, пролиферации и морфогенеза 7-12. Программирование переменного тока эксплантов разрешается развитию функциональной сердце экс естественных условиях 13,14. Использованиеиз эксплантов прививки 15 привели к выявлению минимальной транскрипции переключателя, вызывающего программу дифференцировки нервного гребня 16. Зона limitans intrathalamica (ZLi) передачи сигналов центр, который выделяет звуковой еж (Shh), чтобы контролировать рост и регионализации хвостового переднего мозга. Когда постоянно подвергаются воздействию Shh нейроэпителиальные клетки совместной экспрессии генов трех транскрипционных факторов – Барх, как гомеобокс-2 (barhl2), orthodenticle-2 (Otx2) и ирокез-3 (irx3) – приобрести две характеристики купе ZLi: компетентность в выразить Тсс, и способность отделить от передней части нервной пластинки клеток. В качестве модельной системы, индукция участи ZLi в нейроэпителиальных клеток будет представлено 8.
Эти протоколы направлены на обеспечение простые, дешевые и эффективные инструменты для биологов развития и другими исследователями для изучения фундаментальной MEChanisms ключевых поведения нейронных клеток. Эти протоколы очень разносторонний и позволит расследование большом диапазоне внешних и внутренних нервных сигналов определения. Это позволяет в долгосрочной перспективе в естественных условиях анализа нейронной коммитирование, индуктивных взаимодействий и клеточных поведений.
Protocol
Representative Results
Discussion
Нейронных развитие организованы сложного взаимодействия между клеточными программ развития и сигналов от окружающих тканей (обзор 3,31,32). Здесь мы описываем набор протоколов, которые могут быть использованы в X. Laevis эмбрионов для изучения внешней и внутренней факторы, у?…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The author thanks Hugo Juraver-Geslin, Marion Wassef and Anne Hélène Monsoro-Burq for their help and advice, and the Animal Facility of the Institut Curie. The author thanks Paul Johnson for his editing work on the manuscript. This work was supported by the Centre National de la Recherche Scientifique (CNRS UMR8197, INSERM U1024) and by grants from the “Association pour la Recherche sur le Cancer” (ARC 4972 and ARC 5115; FRC DOC20120605233 and LABEX Memolife) and the Fondation Pierre Gilles de Gennes (FPGG0039).
Materials
| Paraformaldehyde | VWR | 20909.290 | Toxic |
| anion exchange resin beads | Biorad | 140- 1231 | |
| Bovine Serum Albumin | SIGMA | A-7888 | For culture of animal cappH 7.6 |
| Gentamycine | GIBCO | 15751-045 | antibiotic |
| Bovine Serum Albumin | SIGMA | A7906 | for bead preparation |
Referenzen
- Nieuwkoop, P. D. IIB, Pattern formation in the developing central nervous system (CNS) of the amphibians and birds (English). Proceedings of the Koninklijke Nederlandse Akademie van Wetenschappen. 94, 121-127 (1991).
- Nieuwkoop, P. D. The neural induction process; its morphogenetic aspects. Int J Dev Biol. 43, 615-623 (1999).
- Harland, R. Neural induction. Curr Opin Genet Dev. 10, 357-362 (2000).
- Sive, H. L., Grainger, R. M., Harland, R. M. . Early development of Xenopus laevis : a laboratory manual. , (2000).
- Hoppler, S., Vize, P. D., Hoppler, S., Vize, P. D. . Xenopus protocols : post-genomic approaches. , (2012).
- Franklin Hughes, W., La Velle, A. The effects of early tectal lesions on development in the retinal gonglion cell layer of chick embryos. J Comp Neurol. 163, 265-283 (1975).
- Theveneau, E., Mayor, R. Beads on the run: beads as alternative tools for chemotaxis assays. Methods Mol Biol. 769, 449-460 (2011).
- Juraver-Geslin, H. A., Gomez-Skarmeta, J. L., Durand, B. C. The conserved barH-like homeobox-2 gene barhl2 acts downstream of orthodentricle-2 and together with iroquois-3 in establishment of the caudal forebrain signaling center induced by Sonic Hedgehog. Dev Biol. 396, 107-120 (2014).
- Green, J. B., New, H. V., Smith, J. C. Responses of embryonic Xenopus cells to activin and FGF are separated by multiple dose thresholds and correspond to distinct axes of the mesoderm. Cell. 71, 731-739 (1992).
- Wallingford, J. B., Ewald, A. J., Harland, R. M., Fraser, S. E. Calcium signaling during convergent extension in Xenopus. Curr Biol. 11, 652-661 (2001).
- Kiecker, C., Niehrs, C. A morphogen gradient of Wnt/beta-catenin signalling regulates anteroposterior neural patterning in Xenopus. DEVELOPMENT. 128, 4189-4201 (2001).
- Wilson, P. A., Hemmati-Brivanlou, A. Induction of epidermis and inhibition of neural fate by Bmp-4. Nature. 376, 331-333 (1995).
- Afouda, B. A., Hoppler, S. Xenopus explants as an experimental model system for studying heart development. Trends in cardiovascular medicine. 19, 220-226 (2009).
- Afouda, B. A. Stem-cell-like embryonic explants to study cardiac development. Methods Mol Biol. 917, 515-523 (2012).
- Milet, C., Monsoro-Burq, A. H. Dissection of Xenopus laevis neural crest for in vitro explant culture or in vivo transplantation. Journal of visualized experiments: JoVE. , (2014).
- Milet, C., Maczkowiak, F., Roche, D. D., Monsoro-Burq, A. H. Pax3 and Zic1 drive induction and differentiation of multipotent, migratory, and functional neural crest in Xenopus embryos. Proc Natl Acad Sci U S A. 110, 5528-5533 (2013).
- Nieuwkoop, P. D., Faber, J., Nieuwkoop, P. D., Faber, J. . Normal table of Xenopus laevis (Daudin): a systematical and chronological survey of the development from the fertilized egg till the end of metamorphosis. , (1994).
- Harland, R. M. In situ hybridization: an improved whole-mount method for Xenopus embryos. Methods Cell Biol. 36, 685-695 (1991).
- Turner, D. L., Weintraub, H. Expression of achaete-scute homolog 3 in Xenopus embryos converts ectodermal cells to a neural fate. Genes Dev. 8, 1434-1447 (1994).
- Sive, H. L., Grainger, R. M., Harland, R. M. Removing the Vitelline Membrane from Xenopus laevis Embryos. CSH protocols. , (2007).
- Sive, H. L., Grainger, R. M., Harland, R. M. Animal Cap Isolation from Xenopus laevis. CSH protocols. , (2007).
- Sive, H. L., Grainger, R. M., Harland, R. M. Embryo dissection and micromanipulation tools. CSH protocols. , (2007).
- Wilson, S. W., Houart, C. Review: Early Steps in the Development of the Forebrain. Developmental Cell. 6, 167-181 (2004).
- Juraver-Geslin, H. A., Durand, B. C. Early development of the neural plate: new roles for apoptosis and for one of its main effectors caspase-3. Genesis. 53, 203-224 (2015).
- Heasman, J. Patterning the early Xenopus embryo. Development. 133, 1205-1217 (2006).
- Rubenstein, J. L., Martinez, S., Shimamura, K., Puelles, L. The embryonic vertebrate forebrain: the prosomeric model. Science. 266, 578-580 (1994).
- Puelles, L., Rubenstein, J. L. R. Forebrain gene expression domains and the evolving prosomeric model. Trends in Neurosciences. 26, 469-476 (2003).
- Martinez-Ferre, A., Martinez, S. Molecular regionalization of the diencephalon. Frontiers In Neuroscience. 6, 73-73 (2012).
- Scholpp, S., Lumsden, A. Review: Building a bridal chamber: development of the thalamus. Trends in Neurosciences. 33, 373-380 (2010).
- Coffman, C., Harris, W., Kintner, C. Xotch, the Xenopus homolog of Drosophila notch. Science. 249, 1438-1441 (1990).
- Pera, E. M., Acosta, H., Gouignard, N., Climent, M., Arregi, I. Active signals, gradient formation and regional specificity in neural induction. Exp Cell Res. 321, 25-31 (2014).
- Stern, C. D. Neural induction: old problem, new findings, yet more questions. Development. 132, 2007-2021 (2005).
- Juraver-Geslin, H. A., Ausseil, J. J., Wassef, M., Durand, B. C. Barhl2 limits growth of the diencephalic primordium through Caspase3 inhibition of beta-catenin activation. Proc Natl Acad Sci U S A. 108, 2288-2293 (2011).
- Sive, H. L., Grainger, R. M., Harland, R. M. Dissociation and Reaggregation of Xenopus laevis Animal Caps. CSH protocols. , (2007).
- Harland, R. M., Grainger, R. M. Xenopus research: metamorphosed by genetics and genomics. Trends Genet. 27, 507-515 (2011).
- Beccari, L., Marco-Ferreres, R., Bovolenta, P. The logic of gene regulatory networks in early vertebrate forebrain patterning. Mech Dev. 130, 95-111 (2013).
- Pani, A. M., et al. Ancient deuterostome origins of vertebrate brain signalling centres. Nature. 483, 289-294 (2012).
- Holland, L. Z., et al. Evolution of bilaterian central nervous systems: a single origin?. Evodevo. 4, 27 (2013).
- Pratt, K. G., Khakhalin, A. S. Modeling human neurodevelopmental disorders in the Xenopus tadpole: from mechanisms to therapeutic targets. Disease models & mechanisms. 6, 1057-1065 (2013).
- Sasai, Y., Ogushi, M., Nagase, T., Ando, S. Bridging the gap from frog research to human therapy: a tale of neural differentiation in Xenopus animal caps and human pluripotent cells. Development, growth & differentiation. 50, s47-s55 (2008).
