وظيفية تحليل التكملة (FCA): ممارسة مختبر تصميم وتنفيذ المكمل لتدريس الكيمياء الحيوية مسارات
Summary
التحقق من صحة الأنشطة الإنزيمية تشارك في المسارات البيوكيميائية ويمكن توضيح ذلك باستخدام التحليل تكامل وظيفي (FCA). وصفها في هذه المخطوطة هي فحص FCA مما يدل على النشاط الأنزيمي من الأنزيمات المشاركة في عملية التمثيل الغذائي للأحماض الأمينية، استجابة صارمة البكتيرية والحيوي ببتيدوغليكان البكتيرية.
Abstract
وظيفية تكامل فحص (FCA) هو فحص في الجسم الحي الذي يستخدم على نطاق واسع لإلقاء الضوء على وظيفة / دور الجينات / الانزيمات. هذا الأسلوب هو أمر شائع جدا في الكيمياء الحيوية وعلم الوراثة والعديد من التخصصات الأخرى. لمحة شاملة عن تقنية لتكملة تعليم المسارات البيوكيميائية المتعلقة الأحماض الأمينية، ببتيدوغليكان ويقال الاستجابة الصارمة البكتيرية في هذه المخطوطة. ويسلط الضوء على اثنين من cDNAs من المصنع نموذج thaliana كائن نبات الأرابيدوبسيس التي تشارك في عملية التمثيل الغذائي لليسين (L، L-diaminopimelate الألانين (dapL) والألانين التيروزين (tyrB) تشارك في عملية التمثيل الغذائي للالتيروزين والفينيل ألانين. وبالإضافة إلى ذلك، فإن ببتيدوغليكان البكتيرية يتم تمييز مسار المنشطة من خلال تحليل -acetylmuramoyl-L-ألانيل-D-glutamate- المتوسط يغاز -2،6-diaminopimelate (مور) الجين UDP- N من البكتيريا Verrucomicrobium الشائكة التي ينطوي عليها الصليب-linking من ببتيدوغليكان. وذكر أن استجابة صارمة البكتيرية أيضا من خلال تحليل آر إس إتش (ص العلا / ق وعاء ح omolog) الجين bifunctional مسؤولة عن النمط الظاهري شديدة مخاطي في س بكتيريا Novosphingobium. يتم عرض أربعة أمثلة من الهيئة الاتحادية للجمارك. وسوف يركز الفيديو على ثلاثة منها، وهي ليسين، ببتيدوغليكان واستجابة صرامة.
Introduction
ويعرف تكامل وظيفي في سياق توضيح وظيفة (ق) / دور (ق) من الجين كما قدرة مثلي معين أو الجينات orthologous لاستعادة متحولة خاص مع النمط الظاهري ملاحظتها للدولة من النوع البري عندما مثلي أو هو عرض الجينات orthologous في رابطة الدول المستقلة أو العابرة في الخلفية متحولة. وقد استخدم على نطاق واسع هذه التقنية لعزل والتعرف على وظيفة (ق) / دور (ق) من العديد من الجينات. أحد الأمثلة على ذلك هو العزلة وتحديد كربوكسيل orotidine-5-الفوسفات من المبيضات البيض باستخدام متحولة ura3 س الخباز ومتحولة pyrF من E. القولونية. 1 وقد استخدم الباحثون هذه التقنية لتوضيح وظيفة الجينات التي تشارك في عملية التمثيل الغذائي للأحماض الأمينية، ببتيدوغليكان واستجابة الصارمة في برامجها البحثية وأدرجت هذه التقنية ضمن برامجها التعليمية في بiotechnology والبرامج في معهد روتشستر للتكنولوجيا (RIT) العلوم البيولوجية الجزيئية (بي إم بي).
الكتاب تعلم أساسيات الكيمياء الحيوية النباتية / علم الأمراض (FPBP) (هدسون) وBioseparations: المبادئ والممارسات (BPP) (هدسون / Savka)، وهما العلوي قسم المختبر انتخابي يستند دورات في برنامج BMB في جامعة روتشستر للتكنولوجيا. منذ تنتسب بعض الموضوعات التي تمت مناقشتها في هذه الدورات مع اهتماماتهم البحثية، وأدرجت في الكتاب العديد من التقنيات والأدوات التجريبية التي يتم استخدامها في برامجها البحثية المعنية في هذه الدورات المختبري اثنين. أحد الأمثلة على ذلك هو تكامل وظيفي كعملية مختبر لتعزيز مواد المحاضرات المتعلقة الأمينية التمثيل الغذائي للأحماض من النباتات، ببتيدوغليكان والتمثيل الغذائي ردا صارما من البكتيريا.
ثلاثة مسارات الأحماض الأمينية من النباتات التي تمت مناقشتها في FPBB بالطبع هي أن من ليسين (الزنبق)، التيروزين(صور) والفينيل ألانين (PHE). ومن أبرز مسار اليس في سياق بسبب أهمية من الأحماض الأمينية مثل حمض أميني أساسي لجميع الحيوانات وخاصة البشر منذ الحيوانات تفتقر إلى آلية وراثية لتجميع ليز دي نوفو. بالإضافة إلى ذلك، تم اكتشاف مؤخرا أن النباتات تستخدم مسارا لتركيب الزنبق التي تختلف بشكل كبير عن تلك البكتيريا. وقد سهل هذا الاكتشاف جزئيا تكامل وظيفي للE. القولونية diaminopimelate (DAP) المسوخ باستخدام الجينة التي تكود إنزيم L، L-diaminopimelate الألانين (DapL) من thaliana مصنع نموذج نبات الأرابيدوبسيس. 2 يتم عرض مسارات البديل لتركيب اليس من خلال diaminopimelate سيطة في الشكل 1. وبالإضافة إلى ذلك ، تركيب ليز يسهل من خلال الأسرة اسبارتاتي مشتقة من الأحماض الأمينية التي تنظم للغاية. 3 بالإضافة إلى أهميتها في synt البروتينhesis، ويسلط الضوء على إعطاء مسارات للصور وPHE أهميتها في خدمة كمركبات تمهيدا لتحريض استقلاب المركبات فينيل تشارك تجميع المركبات الدفاع النباتية مثل: قلويدات، يغنينس، الفلافونويد، isoflavonoids، حمض hydroxycinnamic وغيرها (4) صور وأبرز مسارات PHE أيضا لإظهار الفرق بين المصنع ومسارات المنشطة البكتيرية. في البكتيريا، وتشارك الألانين انزيم التيروزين (TyrB) في تحريض استقلاب كل من الأحماض الأمينية، في حين أنه في النباتات، الانزيم هو في المقام الأول تشارك في هدم من صور وPHE وغير متورطة في تحريض استقلاب من هذه الأحماض الأمينية. (الشكل 2). 4
ويسلط الضوء على الاختلافات بين موجبة الجرام والجرام البكتيريا سلبية فيما يتعلق بهيكل ببتيدوغليكان (PG) في سياق FPBP. وPG من البكتيريا سالبة الجرام هو من مصلحة بخصوص أمراض النبات استنادا إلى حقيقة أن معظممسببات الأمراض النباتية هي سلبية الغرام. وكشف الاستعراض الأخير بشأن أفضل 10 البكتيرية النباتية مسببات الأمراض التي كلها سلبية الغرام. وكانت البكتيريا من أجناس: الزائفة، رالستونيا، الأجرعية، زانثوموناس، الإيروينية، Xylella، Dickeya وPectobacterium 5 واحد من الاختلافات الكيميائية عند مقارنة الجذعية PG من بكتيريا إيجابية الغرام السلبية وغرام هو الفرق بين عبر ربط الأمينية الأحماض من كلا النوعين. الخطوة الأولى لذلك مختلفة عبر ربط PG يحدث في خطوة هيولي من PG ابتناء وتتيسر بفضل انزيم UDP- N -acetylmuramoyl-L-ألانيل-D-glutamate- المتوسط يغاز -2،6-diaminopimelate (مور) (الشكل 3A). MURE يحفز إضافة مركب ديامين معين في المركز الثالث من جذع الببتيد. 6 في معظم البكتيريا سالبة الجرام، والزنبق قبل الأخيرة السلائف والمتوسط -diaminopimelate ( <eم> م -DAP) بمثابة عبر ربط الأحماض الأمينية واليس يخدم نفس الدور في PG معظم البكتيريا إيجابية الجرام (الشكل 3B). 7 ويرجع ذلك إلى حقيقة أن كلا من م -DAP واليس تمتلك اثنين أمين الجماعات وقادرة على تشكيل اثنين من السندات الببتيد لالببتيد الجذعية عبر ربط.
في Bioseparations: المبادئ والممارسات (BPP) البرنامج الدراسي، وتناقش الاختلافات بين النظم المفتوحة والمغلقة لزراعة البكتيريا وكيف أن مستويات المواد الغذائية سوف تتغير بشكل كبير في كلا النظامين نظرا للتغيرات البيئية. وترتبط هذه الأحداث إلى التغييرات التنظيمية يسمى "تحول أسفل" أو "حتى تحول" الناجمة عن المجاعة أو إمدادات كافية من الأحماض الأمينية أو الطاقة. يمكن أن يحدث "تحول أسفل" استجابة عندما يتم نقل ثقافة البكتيرية من وسيلة غنية ومعقدة إلى متوسطة محددة كيميائيا مع مصدر الكربون واحد. هذا التغيير في البيئة يؤدي إلى cessa السريعنشوئها من الحمض الريبي النووي النقال والريباسي التوليف. هذا وقف النتائج في عدم وجود الريبوسومات والبروتين والحمض النووي على الرغم من وupregulated الحيوي من الأحماض الأمينية.
بعد استجابة "تحول أسفل"، يتم استخدام الريبوسومات القائمة على إنتاج إنزيمات جديدة لتجميع الأحماض الأمينية لم تعد متوفرة في المتوسط أو البيئة. بعد فترة من الوقت، يتم تجميع التوليف الريباسي والريبوسومات جديدة والسكان من الخلايا البكتيرية يبدأ في النمو على الرغم بسعر مخفض. ويطلق على مجرى الأحداث في "استجابة الصارمة" أو "رقابة صارمة"، ومثال على التنظيم الخلوية العالمي ويمكن النظر إليها على أنها آلية لضبط الآلات السكروز الخلية للتعويض عن توافر ركائز المطلوبة واحتياجات الطاقة 8 الرد صرامة مما يتيح البكتيريا على الاستجابة السريعة لتدفقات من المواد الغذائية في البيئة ويساهم وENHances قدرة البكتيريا على المنافسة في البيئات التي يمكن أن تتغير بسرعة فيما يتعلق المغذيات وأو توافر الركيزة 8-9
استجابة صارمة لديه دورا أساسيا في التعبير الجيني عندما تقتصر على توافر الأحماض الأمينية، والكربون والنيتروجين والفوسفات، والأحماض الدهنية. 8،10-14 يتم تنسيق هذه الاستجابة الصارمة من قبل اثنين من النيوكليوتيدات، غوانوزين tetraphosphate (ppGpp) وغوانوزين pentaphosphate (pppGpp) يشار معا في alarmone (ع) ppGpp. على سبيل المثال، عندما يتم الأحماض الأمينية محدودة والتي يمكن أن تؤدي إلى اختناق في تخليق البروتين، وalarmone، غوانوزين 3،5- (مكرر) بيروفوسفات (ppGpp)، والمستمدة من ابتناء من غوانوزين 3-ثنائي فسفات 5 ثلاثي الفوسفات (pppGpp) يتراكم في الخلية. التغير في مستوى (ع) ppGpp وتشارك في التعبير عن الجينات التي تنظم الاستجابة للتغلب على عدم وجود ركائز في البيئة التي تشارك مباشرة في نمو الخلايا والتنت. ودعا اثنين من الجينات التي تشارك في هذه العملية RELA والبقعة. RELA هو (ع) ppGpp مخلقة المرتبطة الريبوسوم التي تشارك في الاستجابة إلى تراكم tRNAs بدون تهمة الذي هو نتيجة للقيود الأحماض الأمينية. وظائف بقعة باعتباره bifunctional (ع) ppGpp مخلقة وهيدرولاز. وتشارك النشاط مخلقة من بقعة في الاستجابة لعدم وجود الكربون والأحماض الدهنية المجاعة. 8 homologs RELA / بقعة على نطاق واسع في النباتات والبكتيريا ويشار إلى آر إس إتش للomologs ح R العلا / S وعاء. 8،10 -12،16 أظهرت مخطوطة الأخيرة أن هناك بروتين آر إس إتش المحددة المعنية في تركيب هذه alarmones من البكتيريا Novosphingobium س ص ص 2-17. 17
هنا نقدم أربعة المسارات البيوكيميائية مصطفة على المقايسات تكامل وظيفي. المقايسات تكامل المبينة في هذه المخطوطة توفر وسيلة لEXPLخام يعمل هذا الاختبار في الجسم الحي كوسيلة لتحديد وتوصيف أو الانزيمات التي من المتوقع أن يكون غير معروف / وظيفة المفترضة (ق) أو كأدوات تعليمية لتكملة تعليم المسارات البيوكيميائية.
Protocol
Representative Results
Discussion
العديد من الدورات التي هي جزء لا يتجزأ من الحيوية ومنهج العلوم البيولوجية الجزيئية في معهد روتشستر للتكنولوجيا وجود مكون المختبر بالإضافة إلى جزء محاضرة للدورة. المناهج الدراسية للعام الدراسي 2014-2015 ويتضمن ما مجموعه 48 دورة، 29 منها تحتوي على عنصر المختبر والتي تمثل ح?…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
AOH وMAS يعترف كلية العلوم وH. مدرسة توماس Gosnell لعلوم الحياة في معهد روتشستر للتكنولوجيا حصول على الدعم. وأيد هذا العمل في جزء من مؤسسة العلوم الوطنية بالولايات المتحدة (NSF) جائزة لAOH MCB-1120541.
Materials
| E. coli mutants | Hudson/Savka lab or CGSC (http://cgsc.biology.yale.edu/) | |
| Electroporator | Biorad-USA | 1652100 |
| Electroporation Cuvettes | Biorad-USA | 1652082 |
| Temperature controlled incubator | Generic | |
| Microcentrifuge | Generic | |
| Luria Agar | Thermofisher Scientific | 22700025 |
| Luria Broth | Thermofisher Scientific | 12795084 |
| M9 Medium | Sigma-Aldrich | 63011 |
| Potato Dextrose Medium | Fisher Scientfic | DF0013-15-8 |
| Kanamycin | Sigma-Aldrich | K1377 |
| Diaminopimelate | Sigma-Aldrich | 92591 |
| Thymine | Sigma-Aldrich | T0376 |
| Chloramphenicol | Sigma-Aldrich | C0378 |
| Tyrosine | Sigma-Aldrich | T3754 |
| Phenlylalanine | Sigma-Aldrich | P2126 |
| Aspartate | Sigma-Aldrich | A9256 |
| Valine | Sigma-Aldrich | V0500 |
| Leucine | Sigma-Aldrich | L8000 |
| Isoleucine | Sigma-Aldrich | I2752 |
| Uracil | Sigma-Aldrich | U0750 |
| Gylcerol | Sigma-Aldrich | G5516 |
| Arabinose | Sigma-Aldrich | A3256 |
| Tetracyline | Sigma-Aldrich | 87128 |
| Taq DNA polymerase | Thermofisher Scientific | 10342-020 |
| Platinum pfx DNA polymerase | Thermofisher Scientific | 11708-013 |
| T4 DNA ligase | Thermofisher Scientific | 15224-041 |
| E coli Dh5-alpha | Thermofisher Scientific | 18258012 |
| E coli Top10 | Thermofisher Scientific | C4040-03 |
| pET100D/topo vector | Thermofisher Scientific | K100-01 |
| pCR2.1 Vector | Thermofisher Scientific | K2030-01 |
Referenzen
- Gillum, A. M., Tsay, E. Y., Kirsch, D. R. Isolation of the Candida albicans gene for orotidine-5′-phosphate decarboxylase by complementation of S. cerevisiae ura3 and E. coli pyrF mutations. Mol Gen Genet. 198, 179-182 (1984).
- Hudson, A. O., Singh, B. K., Leustek, T., Gilvarg, C. An L,L-diaminopimelate aminotransferase defines a novel variant of the lysine biosynthesis pathway in plants. Plant Physiol. 140, 292-301 (2006).
- Jander, G., Joshi, V., Last, R. L. Aspartate-derived amino acid biosynthesis in Arabidopsis thaliana. The Arabidopsis Book. , (2009).
- Prabhu, P., Hudson, A. O. Identification and partial characterization of an L-Tyrosine aminotransferase from Arabidopsis thaliana. Biochemistry Research International. , 549572 (2010).
- Mansfield, J., Genin, S., Magori, S., Citovsky, V., Sriariyanum, M., Ronald, P., Dow, M., Verdier, V., Beer, S. V., Machado , M. A., Toth, I., Salmond, G., Foster, G. D. Top 10 pathogenic bacteria in molecular pathology. Molecular Plant Pathology. 13, 614-629 (2012).
- McGroty, S. E., Pattaniyil, D. T., Patin, D., Blanot, D., Ravichandran, A. C., Suzuki, H., Dobson, R. C., Savka, M. A., Hudson, A. O. Biochemical Characterization of UDP-N-acetylmuramoyl-L-alanyl-D-glutamate: meso-2,6-diaminopimelate ligase (MurE) from Verrucomicrobium spinosum DSM 4136T. PLoS ONE. 8 (6), e66458 (2013).
- Hutton, C. A., Perugini, M. A., Gerrard, J. A. Inhibition of lysine biosynthesis: an evolving antibiotic strategy. Mol Biosyst. 3, 458-465 (2007).
- Potrykus, K., Cashel, M. (p)ppGpp: still magical. Annu Rev Microbiol. 62, 35-51 (2008).
- Dalebroux, Z. D., Svensson, S. L., Gaynor, E. C., Swanson, M. S. ppGpp Conjures Bacterial Virulence. Microbiology and Molecular Biology Reviews. 74, 171-199 (2010).
- Cashel, M., Gentry, D. J., Hernandez, V. J., Vinella, D., Neidhardt, F. C., Curtiss, R., Ingraham, J. L., Lin, E. C. C., Low, K. B., Magasanik, B., Reznikoff, W. S., Riley, M., Schaechter, M., Umbarger, H. E. The stringent response. Escherichia coli and Salmonella typhimurium: cellular and molecular biology. , 1458-1496 (1996).
- Chatterji, D., Ojha, A. K. Revisiting the stringent response, ppGpp and starvation signaling. Curr. Opin. Microbiol. 4, 160-165 (2001).
- Jain, V., Kumar, M., Chatterji, D. ppGpp: stringent response and survival. J. Microbiol. 44, 1-10 (2006).
- Kramer, G. F., Baker, J. C., Ames, B. N. Near-UV stress in Salmonella typhimurium: 4-thiouridine in tRNA, ppGpp, and pppGpp as components of an adaptive response. J. Bacteriol. 170, 2344-2351 (1988).
- Braeken, K., Moris, M., Daniels, R., Vanderleyden, J., Michiels, J. New horizons for (p)ppGpp in bacterial and plant physiology. Trends Microbiol. 14, 45-54 (2006).
- Joseleau-Petit, D., Vinella, D., D’Ari, R. Metabolic alarms and cell division in Escherichia coli. J. Bacteriol. 181, 9-14 (1999).
- Mittenhuber, G. Comparative genomics and evolution of genes encoding bacterial (p) ppGpp synthetases/hydrolases (the Rel, RelA, and SpoT proteins). J. Mol. Microbiol. Biotechnol. 3, 585-600 (2001).
- Gan, H. M., Buckley, L., Szegedi, E., Hudson, A. O., Savka, M. A. Identification of an rsh Gene from a Novosphingobium sp. Necessary for Quorum-Sensing Signal Accumulation. J. Bacteriol. 191, 2551-2560 (2009).
- Nachar, V. R., Savka, F. C., McGroty, S. E., Donovan, K. A., North, R. A., Dobson, R. C., Buckley, L. J., Hudson, A. O. Genomic and biochemical analysis of the diaminopimelate and lysine biosynthesis pathway in Verrucomicrobium spinosum: Identification and partial characterization of L,L-diaminopimelate aminotransferase and UDP-N-acetylmuramoylalanyl-D-glutamyl-2,6-meso-diaminopimelate ligase. Front. Microbiol. 3, 183 (2012).
- Hudson, A. O., Giròn, I., Dobson, R. C. J. Crystallization and preliminary X-ray diffraction analysis of L,L-diaminopimelate aminotransferase (DapL) from Chlamydomonas reinhardtii. Acta Cryst. 67, 140-143 (2011).
- Dobson, R. C. J., Gir òn, I., Hudson, A. O. L,L-Diaminopimelate Aminotransferase from Chlamydomonas reinhardtii: A Target for Algaecide Development. PLoS ONE. 6 (5), e20439 (2011).
- Guzman, L. M., Belin, D., Carson, M. J., Beckwith, J. Tight regulation, modulation, and high-level expression by vectors containing the arabinose pBAD promoter. J. Bacteriol. 177, 4121-4130 (1995).
- Sambrook, J., Russell, D. W. . Molecular Cloning: A laboratory manual. , (2001).
- Lugtenberg, E. J., van Schijndel-van Dam, A. Temperature-sensitive mutants of Escherichia coli K-12 with low activity of the diaminopimelic acid adding enzyme. J. Bacteriol. 110, 41-46 (1972).
- Mavrides, C., Orr, W. Multispecific aspartate and aromatic amino acid aminotransferases in Escherichia coli. J. Biol Chem. 250, 4128-4133 (1975).
- Gelfand, D. H., Steinberg, R. A. Escherichia coli mutants deficient in the aspartate and aromatic amino acid aminotransferases. J. Bacteriol. 130, 429-440 (1977).
- Whitaker, R. J., Gaines, C. G., Jensen, R. A. A multispecific quintet of aromatic aminotransferases that overlap different biochemical pathways in Pseudomonas aeruginosa. J. Biol Chem. 257, 13550-13556 (1982).
- Raskin, D. M., Judson, N., Mekalanos, J. J. Regulation of the stringent response in the essential function if the conserved bacterial G protein CgtA in Vibrio cholera. Proc Natl Acad Sci, USA. 104, 4636-4641 (2007).
- Ditta, G., Stanfield, S., Corbin, D., Helinski, D. R. Broad host range DNA cloning system for Gram-negative bacteria: construction of a gene bank of Rhizobium meliloti. Proc Natl Acad Sci, USA. 77, 7347-7351 (1980).
- Watanabe, A., Suzuki, M., Ujiie, S., Gomi, K. Purification and enzymatic characterization of a novel β-1,6-glucosidase from Aspergillus oryzae. J Biosci Bioeng. , (2015).
- Song, J. T., Lu, H., McDowell, J. M., Greenberg, J. T. A key role for ALD1 in activation of local and systemic defenses in Arabidopsis. Plant J. 40, 200-212 (2004).
- Rost, B., Liu, J., Nair, R., Wrzeszczynski, K. P., Ofran, Y. Automatic prediction of protein function. Celuular and Molecular Life Sciences. 60, 2637-2650 (2003).
- Norris, S. R., Shen, X., Penna, D. D. Complementation of the Arabidopsis pds1 mutation with the gene encoding p-Hyrdoxyphenylpyruvate dioxygenase. Plant Physiol. 117, 1317-1323 (1998).
- Mohler, W. A., Blau, H. M. Gene expression and cell fusion analyzed by lacZ complementation in mammalian cells. Proc Natl Acad Sci, USA. 93, 12423-12427 (1996).
