機能的相補性分析（FCA）：生化学的経路の授業を補足するように設計および実装実験演習
Summary
生化学的経路に関与する酵素活性の検証は、機能的相補性分析（FCA）を用いて明らかにすることができます。アミノ酸は、細菌の緊縮応答および細菌ペプチドグリカン生合成の代謝に関与する酵素の酵素活性を示すFCAアッセイは本稿で説明します。
Abstract
機能的相補性アッセイ（FCA）が広く遺伝子/酵素の機能/役割を解明するために使用されるin vivoアッセイです。この技術は、生化学、遺伝学および他の多くの分野で非常に一般的です。酸、ペプチドグリカンや細菌の緊縮応答は、この原稿で報告されたアミノ酸に関連する生化学的経路の教育を補完する技術の包括的な概観。リジン（L、L-ジアミノピメリン酸アミノトランスフェラーゼ（DAPL）およびチロシンとフェニルアラニンの代謝に関与するチロシンアミノトランスフェラーゼ（なtyrB）の代謝に関与しているモデル植物生物シロイヌナズナ（Arabidopsis thaliana）からの2つのcDNAが強調されている。また、細菌のペプチドグリカン同化経路は、クロスに関与する細菌Verrucomicrobium有棘からUDP-N -acetylmuramoyl -L-アラニル-D-グルタメートメソ -2,6-ジアミノピメリン酸リガーゼ（牟礼）遺伝子を解析して強調表示されていますペプチドグリカンの-linking。細菌の緊縮応答はまた、RSH（R ELA / sのポット時間 omolog）細菌Novosphingobium属におけるハイパームコイド表現型の原因二官能性遺伝子の解析を通じて報告される。FCAの4つの例が提示されています。ビデオは、それらの3、すなわちリジン、ペプチドグリカンと緊縮応答に焦点を当てます。
Introduction
遺伝子の機能を解明するの文脈で機能的相補性（S）/役割（複数可）は、相同野生型状態を観察可能な表現型を有する特定の変異体を回復するために特定の相同またはオーソロガス遺伝子の能力として定義されますまたはオルソロガス遺伝子変異バックグラウンドにシスまたはトランスで導入されます。この技術は、広く分離し、機能（複数可）は、多くの遺伝子/役割（複数可）を識別するために使用されてきました。 1つの特定の例は、SのURA3変異体を使用して、 カンジダ・アルビカンスからオロチジン-5-リン酸脱炭酸酵素の単離および同定でありますcerevisiaeおよびE.ののpyrF変異体大腸菌 。1著者は、アミノ酸、ペプチドグリカンとその研究プログラムにおける緊縮応答の代謝に関与し、Bでの教育プログラムにこの技術を組み込んだ遺伝子の機能を解明するために、この技術を使用していますiotechnologyおよび分子バイオサイエンス（BMB）ロチェスター工科大学（RIT）でのプログラム。
原則と慣行（BPP）（ハドソン/ Savka）、RITでBMBのプログラムで2つの上部の分割選択科目の研究室ベースのコース：著者らは、植物生化学/病理学（FPBP）（ハドソン）とバイオセパレーションの基礎を教えます。コースで議論されたトピックのいくつかは、彼らの研究分野で提携しているので、著者らは、これらの2実験室ベースのコースに、それぞれの研究プログラムで使用されている技術と実験的なツールの多くが組み込まれています。その一例は、植物、ペプチドグリカンや細菌からの緊縮応答代謝から酸代謝をアミノ酸に関連する講義資料を強化するために、実験室の練習として機能的相補性です。
FPBBコースで議論されている植物由来のアミノ酸経路のうちの3つがあることリシン（リジン）の、チロシン（tyrで）とフェニルアラニン（Pheで）。動物がLys デノボを合成する遺伝子機構を欠いているため、Lysの経路があるため、すべての動物、特にヒトのための必須アミノ酸などのアミノ酸の重要性のコースで強調表示されます。また、最近、植物は細菌のものとは大きく異なるリジンの合成経路を用いることが発見されました。この発見は、部分的にEの機能的相補性によって促進されましたコリジアミノピメリン酸（DAP）のモデル植物のシロイヌナズナ（Arabidopsis thaliana）からの酵素L、L-ジアミノピメリン酸アミノトランスフェラーゼ（DAPL）をコードする遺伝子を用いて、変異体2、中間ジアミノピメリン介してリジンの合成のための変形経路は、 図1に示されている。また、リジンの合成は、高度に調節されているアミノ酸のアスパラギン酸由来のファミリーを介して容易にする。3タンパク質SYNTにおけるそれらの重要性に加えてhesisは、TyrおよびPheのための経路はフェニル化合物の同化作用のための前駆体化合物のような植物の防御化合物の合成関与となる中で、その重要性を考慮強調表示されています：アルカロイド、リグニン、フラボノイド、イソフラボノイド、とりわけヒドロキシ酸を4 TyrでおよびPhe経路は、植物や細菌の同化経路の違いを示すために強調されています。植物において、酵素は、TyrおよびPheへの異化作用における主に関与し、これらのアミノ酸の同化に関与していないのに対し、細菌は、酵素チロシンアミノトランスフェラーゼ（なtyrB）は、両方のアミノ酸の同化作用に関与しています。 （ 図2）。4
ペプチドグリカンの構造に関するグラム陽性およびグラム陰性菌（PG）との相違点は、FPBPコースで強調表示されます。グラム陰性菌のPGは、そのほとんど事実にに基づいて、植物病理学に関する関心があります植物病原体は、グラム陰性です。トップ10の細菌フィト病原体に関する最近のレビューは、すべてのグラム陰性であることを明らかにしました。細菌は属からのものであった： シュードモナス 、 ラルストニア 、 アグロバクテリウム 、 キサントモナス 、 エルウィニア 、Xylella、DickeyaとPectobacterium化学違いの5つのグラム陰性およびグラム陽性菌のPGステムを比較する架橋アミノ酸の差があります両方のタイプの酸です。 PGの異なる架橋のための最初のステップは、PG同化の細胞質工程で起こり、酵素UDP- N -acetylmuramoyl -L-アラニル-D-グルタメートメソ -2,6-ジアミノピメリン酸リガーゼ（のMurE）によって促進されます（ 図3A）。 MurEはペプチドステムの3番目の位置における特定のジアミン化合物の付加を触媒する大部分のグラム陰性細菌で6、最後から二番目のLysの前駆体、 メソ -diaminopimelate（ <e架橋アミノ酸およびLysは、ほとんどのグラム陽性菌のPG（ 図3B）で同じ役割を果たすようメートル>メートルの-dap）が提供しています。7これが原因メートルの -dapおよびLys両方が2つのアミンを保有するという事実によるものであり、グループとは、ペプチド幹架橋のための2つのペプチド結合を形成することができます。
バイオセパレーションの場合：原則と実践（BPP）もちろん、細菌の培養のためのオープンとクローズドシステムの違いとどのように栄養のレベルは、環境の変化が議論されていると、両方のシステムで大幅に変更されます。これらのイベントは、「シフトダウン」や飢餓やアミノ酸やエネルギーの十分な供給を契機「シフトアップ」と呼ばれる規制の変更にリンクされています。細菌培養物を単一炭素源と化学的に定義された培地に豊かで複雑な媒体から転送されたときに、「シフトダウン」応答が発生する可能性があります。環境の変化が急速cessaにつながりますtRNAとrRNAの合成化。アミノ酸の生合成をアップレギュレートされていてもリボソーム、タンパク質およびDNA合成の欠如でこの停止をもたらします。
「ダウンシフト」の応答に続いて、既存のリボソーム培地または環境で利用できなくなったアミノ酸を合成する新しい酵素を生成するために使用されます。一定期間後、rRNAの合成と新しいリボソームが組み立てられ、細菌細胞の集団を減少した速度であるが成長し始めます。イベントのコースは「 緊縮応答」または「 ストコントロール」と呼ばれ 、世界的な細胞制御の一例であり、必要な基質およびエネルギー需要の利用可能性を補償するために、細胞の生合成機構を調整する機構と考えることができますされています8緊縮応答は、このような環境での栄養素のフラックスに迅速に対応するために、細菌を可能にし、貢献し、ENH栄養素およびまたは基板の可用性に関して迅速に変更することができる環境で競争する細菌の能力をances。8-9
緊縮応答は、アミノ酸、炭素、窒素、リン酸、および脂肪酸の利用が制限されている遺伝子発現において重要な役割を持っている。8,10-14この緊縮応答は、2個のヌクレオチド、グアノシン四リン酸（ppGpp）とグアノシンによって調整されています五（pppGpp）は、一般的にalarmone（P）ppGppとして一緒に呼ばれます。例えば、アミノ酸が限ら-れているタンパク質合成-alarmone、グアノシンのボトルネックにつながる可能性が3,5-（ビス）グアノシンの同化由来ピロリン酸（ppGpp）、3-二リン酸5 – 三リン酸（pppGpp）が蓄積セルインチ（p）ppGppレベルの変化は、直接、細胞増殖及びdevelopmenに関与している環境での基質の不足を克服するために応答を調節する遺伝子の発現に関与しますトン。このプロセスに関与する遺伝子のうちの2つがRELAとスポットと呼ばれています。 RelAのアミノ酸の制限の結果である非荷電tRNAの蓄積に応答に関与するリボソーム関連（p）ppGpp合成酵素です。二官能性（P）ppGpp合成酵素と加水分解酵素などのスポット機能します。スポットの合成酵素活性は、炭素および脂肪酸飢餓の欠如に応答に関与している。8のRelA /スポットホモログは、植物や細菌に広く分布しており、R ELA / Sポット時間 omologsのためのrshと呼ばれている。8,10 -12,16最近の原稿は、細菌Novosphingobium属 Rrを2月17日からこれらのalarmonesの合成に関与する特定のrshタンパク質が存在することを示した。17
ここでは、機能的相補アッセイにつなが4生化学的経路を提示します。この原稿で概説相補アッセイは正しくありませんするための手段を提供します鉱石は識別し、または生化学的経路の授業を補完するために、未知/推定機能（複数可）または教育ツールとしてを有することが予測される酵素を特徴づけるための手段として、このインビボアッセイを使用します。
Protocol
Representative Results
Discussion
ロチェスター工科大学でバイオテクノロジーおよび分子バイオサイエンスのカリキュラムに不可欠なコースの多くは、当然の講義部分に加えて、研究室のコンポーネントを持っています。学年2014-2015ためのカリキュラムは、約60％を占める研究室のコンポーネントが含まれている29そのうち48コースの合計が含まれています。そのようなコースは、植物生化学・病理学（FPBP）、ブレンド講義/?…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
AOHとMASは、サポートのための科学技術のロチェスター研究所の生命科学のトーマスH. Gosnell学校の大学を認めています。この作品は、AOH MCB-1120541に米国国立科学財団（NSF）賞によって部分的にサポートされていました。
Materials
| E. coli mutants | Hudson/Savka lab or CGSC (http://cgsc.biology.yale.edu/) | |
| Electroporator | Biorad-USA | 1652100 |
| Electroporation Cuvettes | Biorad-USA | 1652082 |
| Temperature controlled incubator | Generic | |
| Microcentrifuge | Generic | |
| Luria Agar | Thermofisher Scientific | 22700025 |
| Luria Broth | Thermofisher Scientific | 12795084 |
| M9 Medium | Sigma-Aldrich | 63011 |
| Potato Dextrose Medium | Fisher Scientfic | DF0013-15-8 |
| Kanamycin | Sigma-Aldrich | K1377 |
| Diaminopimelate | Sigma-Aldrich | 92591 |
| Thymine | Sigma-Aldrich | T0376 |
| Chloramphenicol | Sigma-Aldrich | C0378 |
| Tyrosine | Sigma-Aldrich | T3754 |
| Phenlylalanine | Sigma-Aldrich | P2126 |
| Aspartate | Sigma-Aldrich | A9256 |
| Valine | Sigma-Aldrich | V0500 |
| Leucine | Sigma-Aldrich | L8000 |
| Isoleucine | Sigma-Aldrich | I2752 |
| Uracil | Sigma-Aldrich | U0750 |
| Gylcerol | Sigma-Aldrich | G5516 |
| Arabinose | Sigma-Aldrich | A3256 |
| Tetracyline | Sigma-Aldrich | 87128 |
| Taq DNA polymerase | Thermofisher Scientific | 10342-020 |
| Platinum pfx DNA polymerase | Thermofisher Scientific | 11708-013 |
| T4 DNA ligase | Thermofisher Scientific | 15224-041 |
| E coli Dh5-alpha | Thermofisher Scientific | 18258012 |
| E coli Top10 | Thermofisher Scientific | C4040-03 |
| pET100D/topo vector | Thermofisher Scientific | K100-01 |
| pCR2.1 Vector | Thermofisher Scientific | K2030-01 |
Referenzen
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