Funktionelle Komplementierung Analyse (FCA): A Laboratory Übung konzipiert und umgesetzt, die Lehre von Biochemical Pathways zur Ergänzung
Summary
Die Validierung der enzymatischen Aktivitäten in biochemischen Wege beteiligt sind, können mit Hilfe der funktionellen Komplementierung Analyse (FCA) erläutert. Beschrieben in diesem Manuskript ist das FCA-Assay der enzymatischen Aktivität von Enzymen involviert in den Metabolismus von Aminosäuren, bakterielle stringenten Antwort und bakterielle Peptidoglycan-Biosynthese zeigen.
Abstract
Funktionelle Komplementierung Assay (FCA) ist ein in – vivo – Test , die häufig verwendet wird , um die Funktion / Rolle der Gene / Enzyme aufzuklären. Diese Technik ist in der Biochemie, Genetik und viele andere Disziplinen sehr verbreitet. Einen umfassenden Überblick über die Technik, um die Lehre der biochemischen Wege zur Ergänzung betreffend Säuren, Peptidoglycan und die bakterielle strenge Reaktion auf Amino ist in diesem Manuskript berichtet. Zwei cDNAs aus der Modellpflanzenorganismus Arabidopsis thaliana , die im Metabolismus von Lysin (L, L-Diaminopimelat – Aminotransferase (DAPL) und Tyrosin – Aminotransferase (tyrB) involviert in den Metabolismus von Tyrosin und Phenylalanin sind markiert. Zusätzlich beteiligt sind, die bakterielle Peptidoglycan anabolen Stoffwechselweg wird durch die Analyse des UDP- N -acetylmuramoyl-L-alanyl-D-glutamat meso -2,6-Diaminopimelat – Ligase (murE) Gen aus dem Bakterium Verrucomicrobium spinosum im Quer beteiligt hervorgehoben-Verknüpfung von Peptidoglycan. Die bakterielle stringent Antwort wird auch durch die Analyse des rsh (r ELA / s poT h omolog) bifunktionellen Gen für eine hyper mukoiden Phänotyp in dem Bakterium Novosphingobium sp berichtet. Vier Beispiele von FCA vorgestellt. Das Video konzentriert sich auf drei von ihnen, nämlich Lysin, Peptidoglykan und die strenge Antwort.
Introduction
Funktionelle Komplementation im Zusammenhang mit der Funktion Aufklären (n) / Rolle (n) eines Gens wird als die Fähigkeit einer bestimmten homologe oder orthologe Gen definiert eine bestimmte Mutante mit einer beobachtbaren Phänotyp zu dem Wildtyp-Zustand, wenn die homologe wiederherzustellen oder orthologen Gen in cis oder trans in den mutierten Hintergrund eingeführt. Diese Technik wurde verwendet, um weithin isolieren und die Funktion (en) / Rolle (n) vieler Gene zu identifizieren. Ein besonderes Beispiel ist die Isolierung und Identifizierung von Orotidin-5-phosphat – Decarboxylase aus Candida albicans unter Verwendung des ura3 – Mutante von S. cerevisiae und die pyrF Mutante von E. coli. 1 Die Autoren haben diese Technik verwendet , um die Funktion der Gene zu erhellen , die in den Stoffwechsel von Aminosäuren, Peptidoglycan und dem stringent Reaktion in ihre Forschungsprogramme beteiligt sind und haben diese Technik in ihre Lehrprogramme in der B eingebautiotechnology und Molecular Bioscience (BMB) Programm am Rochester Institute of Technology (RIT).
Die Autoren lehren Grundlagen der Pflanzenbiochemie / Pathologie (FPBP) (Hudson) und Bioseparations: Principles and Practices (BPP) (Hudson / Savka), zwei obere Abteilung Wahl Labor basierte Kurse im BMB-Programm an der RIT. Da einige der Themen, die in den Kursen diskutiert mit ihren Forschungsinteressen verbunden sind, haben die Autoren viele der Techniken und experimentellen Tools integriert, die in ihren jeweiligen Forschungsprogrammen in diese beiden Labor-basierte Kurse verwendet werden. Ein solches Beispiel ist funktionelle Komplementation als Laborübung der Vortragsmaterialien zu verstärken Bezug Säuremetabolismus von Pflanzen Amino, Peptidoglycan und dem stringent Reaktion Stoffwechsel von Bakterien.
Drei der Aminosäurewege von Pflanzen, die in der FPBB natürlich behandelt werden, sind die von Lysin (lys), Tyrosin(Tyr) und Phenylalanin (Phe). Der lys Weg wird im Rahmen hervorgehoben wegen der Bedeutung der Aminosäure als essentielle Aminosäure für alle Tiere insbesondere Menschen , da Tiere , die genetische Maschinerie fehlt lys de novo zu synthetisieren. Darüber hinaus wurde entdeckt, dass es vor kurzem Pflanzen einen Weg für die Synthese von lys verwenden, die von der von Bakterien signifikant unterscheidet. Diese Entdeckung wurde zum Teil durch funktionelle Komplementierung der E. erleichtert coli Diaminopimelat (dap) , Mutanten unter Verwendung eines Gens , das das Enzym L, L-Diaminopimelat – Aminotransferase (DAPL) von der Modellpflanze Arabidopsis thaliana. 2 ist die Variante Wege für die Synthese von lys durch den Zwischen Diaminopimelat kodiert sind in Fig. 1 gezeigten Zusätzlich erleichtert die Synthese von lys durch die Aspartat – Familie abgeleitet von Aminosäuren , die stark reguliert. 3 neben ihrer Bedeutung in Protein synthesis, die Wege für tyr und phe markiert sind ihre Bedeutung gegeben in die als Vorläuferverbindungen für den Anabolismus von Phenylpropanstoffwechsels Verbindungen , die die Synthese von Pflanzenabwehrstoffe beteiligt , wie:. Alkaloide, Lignine, Flavonoide, Isoflavonoide, Hydroxyzimtsäure unter anderem 4 Die tyr und phe Wege werden auch den Unterschied zu zeigen zwischen der Pflanzen- und Bakterien anabole Wege markiert. In Bakterien wird das Enzym Tyrosin-Aminotransferase (tyrB) in den Anabolismus beider Aminosäuren beteiligt sind, wohingegen in Pflanzen, das Enzym in den Katabolismus von tyr und phe primär beteiligt ist und nicht in den Anabolismus dieser Aminosäuren beteiligt. (Abbildung 2). 4
Die Unterschiede zwischen grampositiven und gramnegativen Bakterien in Bezug auf die Struktur von Peptidoglycan (PG) im FPBP natürlich hervorgehoben. Die PG von Gram-negativen Bakterien ist von Interesse, hinsichtlich Pflanzenpathologie basiert auf der Tatsache, dass die meistenPflanzenpathogene sind Gram-negative. Eine aktuelle Übersicht über die Top-10-bakterielle Phyto-Erreger ergeben, dass alle Gram negativ sind. Die Bakterien wurden aus den Gattungen:. Pseudomonas, Ralstonia, Agrobacterium, Xanthomonas, Erwinia, Xylella, Dickeya und Pectobacterium 5 eines der chemischen Unterschiede , wenn die PG Stamm Gram – negative und Gram – positive Bakterien Vergleich ist der Unterschied zwischen dem Vernetzungs amino Säuren beider Typen. Der erste Schritt für die unterschiedlichen Quervernetzung von PG in der zytoplasmatischen Schritt des PG Anabolismus auftritt , und wird durch das Enzym UDP- N -acetylmuramoyl-L-alanyl-D-glutamat meso -2,6-Diaminopimelat – Ligase (Mure) erleichtert , (3A). Mure katalysiert die Addition einer bestimmten Diaminverbindung an der dritten Position des Peptids Stamm. 6 in den meisten Gram – negativen Bakterien, die vorletzte lys Vorläufer meso -diaminopimelate ( <em> m -dap) dient als Vernetzungs Aminosäure und lys dient die gleiche Rolle in der PG für die meisten Gram – positiven Bakterien (3B). 7. Dies ist auf die Tatsache zurückzuführen, dass sowohl m -dap und lys besitzen zwei Amin Gruppen und sind zur Bildung von zwei Peptidbindungen zum Peptidschaft Vernetzung fähig.
In der Bioseparations: Principles and Practices (BPP) Natürlich sind die Unterschiede zwischen offenen und geschlossenen Systemen für die Kultivierung von Bakterien und wie Nährstoffgehalt deutlich aufgrund von Umgebungsänderungen in beiden Systemen ändern werden diskutiert. Diese Ereignisse verknüpft sind regulatorische Änderungen ein "Herunterschalten" oder "hochschalten" ausgelöst durch Verhungern oder eine ausreichende Versorgung mit Aminosäuren oder Energie. Die "herunterschalten" Reaktion kann auftreten, wenn eine Bakterienkultur aus einer reichen und komplexen Medium zu einem chemisch definierten Medium mit einem einzigen Kohlenstoffquelle übertragen wird. Diese Änderung in der Umwelt führt zur schnellen Cessation von tRNA und rRNA-Synthese. Diese Einstellung führt zu dem Mangel an Ribosomen, Protein- und DNA-Synthese, obwohl die Biosynthese von Aminosäuren aufreguliert.
Im Anschluss an die "herunterschalten" Reaktion, werden die vorhandenen Ribosomen verwendet, um neue Enzyme zu produzieren, die die Aminosäuren nicht mehr verfügbar im Medium oder Umwelt zu synthetisieren. Nach einer gewissen Zeit werden rRNA Synthese und neue Ribosomen zusammengebaut und die Population von Bakterienzellen beginnt mit einer reduzierten Rate zu wachsen, obwohl. Der Verlauf der Ereignisse wird die "strengen Antwort" oder "strenge Kontrolle" bezeichnet und ist ein Beispiel für globale Zellregulation und kann zur Einstellung der Zelle Biosynthesemaschinerie als Mechanismus gedacht werden , um die Verfügbarkeit der erforderlichen Substrate und Energiebedarf zu kompensieren . 8 ist die stringent Reaktion ermöglicht somit Bakterien schnell Flüsse von Nährstoffen in der Umgebung zu reagieren und trägt und enhANCES die Fähigkeit von Bakterien in Umgebungen zu konkurrieren, die sich schnell in Bezug auf Nährstoff ändern und oder Substratverfügbarkeit. 8-9
Die stringenten Antwort hat eine integrale Rolle bei der Genexpression , wenn die Verfügbarkeit von Aminosäuren, Kohlenstoff, Stickstoff, Phosphat und Fettsäuren begrenzt sind. 8,10-14 Diese stringenten Antwort durch zwei Nucleotide koordiniert ist, Guanosin tetraphosphat (ppGpp) und Guanosin Pentaphosphat (pppGpp) bezeichnet allgemein zusammen als alarmone (p) ppGpp. Wenn beispielsweise sind Aminosäuren begrenzt, die zu einem Engpass bei der Proteinsynthese-the alarmone führen kann, Guanosin 3,5- (bis) pyrophosphat (ppGpp) von Anabolismus von Guanosin 5-Triphosphat-3-diphosphat abgeleitet (pppGpp) ansammelt in der Zelle. Die Änderung in der (p) ppGpp-Ebene ist in der Expression von Genen beteiligt, die die Reaktion regulieren, das Fehlen von Substraten in die Umwelt zu überwinden, die in das Zellwachstum und developmen direkt beteiligt sindt. Zwei der Gene, die an diesem Prozess beteiligt sind, relA und spoT genannt. RelA ist eine Ribosomen-assoziierte (p) ppGpp-Synthetase, die in der Antwort auf die Anhäufung von unbeladenen tRNAs beteiligt ist, die das Ergebnis der Aminosäure-Begrenzung ist. SPoT Funktionen als bifunktionelles (p) ppGpp-Synthetase und Hydrolase. Die Synthetase – Aktivität von Flecks in der Antwort auf den Mangel an Kohlenstoff und Fettsäure Hunger beteiligt. 8 Die RelA / SPoT Homologe sind weit verbreitet in Pflanzen und Bakterien und sind als Rsh für R ela / S poT h omologs bezeichnet. 8.10 -12,16 eine kürzlich Manuskript zeigte , dass es eine spezifische Rsh Protein in der Synthese dieser Alarmone aus dem Bakterium Novosphingobium sp Rr 2-17 17 beteiligt ist.
Hier präsentieren wir vier biochemischen Wege zu den funktionellen Komplementierung Assays gebunden. Die Komplementierung Assays in diesem Manuskript skizziert bietet eine Allee zu explore Verwendung dieses in vivo – Test als Mittel zur Identifizierung und Charakterisierung oder Enzyme , die vorhergesagt werden unknown / putative Funktion haben (s) oder als Lehrmittel die Lehre der biochemischen Wege zu ergänzen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Viele der Kurse, die auf die Biotechnologie und Molekulare Biowissenschaften Lehrplan am Rochester Institute of Technology integral sind, haben eine Laborkomponente zusätzlich zur Vorlesung Teil des Kurses. Der Lehrplan für das akademische Jahr 2014-2015 enthält insgesamt 48 Kurse, von denen 29 eine Laborkomponente enthalten, die etwa 60% darstellen. Ein solcher Kurs ist Grundlagen der Pflanzenbiochemie und Pathologie (FPBP), einem gemischten Vorlesung / Praktikum und Bioseparations: Principles and Practices (BPP), e…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
AOH und MAS erkennt das College of Science und der Thomas H. Gosnell School of Life Sciences am Rochester Institute of Technology für die Unterstützung. Diese Arbeit wurde teilweise von der United States National Science Foundation (NSF) Auszeichnung AOH MCB-1120541 unterstützt.
Materials
| E. coli mutants | Hudson/Savka lab or CGSC (http://cgsc.biology.yale.edu/) | |
| Electroporator | Biorad-USA | 1652100 |
| Electroporation Cuvettes | Biorad-USA | 1652082 |
| Temperature controlled incubator | Generic | |
| Microcentrifuge | Generic | |
| Luria Agar | Thermofisher Scientific | 22700025 |
| Luria Broth | Thermofisher Scientific | 12795084 |
| M9 Medium | Sigma-Aldrich | 63011 |
| Potato Dextrose Medium | Fisher Scientfic | DF0013-15-8 |
| Kanamycin | Sigma-Aldrich | K1377 |
| Diaminopimelate | Sigma-Aldrich | 92591 |
| Thymine | Sigma-Aldrich | T0376 |
| Chloramphenicol | Sigma-Aldrich | C0378 |
| Tyrosine | Sigma-Aldrich | T3754 |
| Phenlylalanine | Sigma-Aldrich | P2126 |
| Aspartate | Sigma-Aldrich | A9256 |
| Valine | Sigma-Aldrich | V0500 |
| Leucine | Sigma-Aldrich | L8000 |
| Isoleucine | Sigma-Aldrich | I2752 |
| Uracil | Sigma-Aldrich | U0750 |
| Gylcerol | Sigma-Aldrich | G5516 |
| Arabinose | Sigma-Aldrich | A3256 |
| Tetracyline | Sigma-Aldrich | 87128 |
| Taq DNA polymerase | Thermofisher Scientific | 10342-020 |
| Platinum pfx DNA polymerase | Thermofisher Scientific | 11708-013 |
| T4 DNA ligase | Thermofisher Scientific | 15224-041 |
| E coli Dh5-alpha | Thermofisher Scientific | 18258012 |
| E coli Top10 | Thermofisher Scientific | C4040-03 |
| pET100D/topo vector | Thermofisher Scientific | K100-01 |
| pCR2.1 Vector | Thermofisher Scientific | K2030-01 |
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