Fonksiyonel tamamlama Analizi (FCA): Tasarım ve Biyokimyasal Yolların Öğretim Ek için Uygulanan A Laboratory Egzersiz
Summary
biyokimyasal yollarla ilgili enzimatik faaliyetlerin doğrulama fonksiyonel tamamlama analizi (FCA) kullanılarak aydınlatılmıştır edilebilir. amino asitler, bakteriyel katı cevabı ve bakteriyel peptidoglikan biyosentezinin metabolizmasında rol oynayan enzimlerin enzimatik aktivitesi gösteren FCA deneyi Bu yazıda tarif edilmektedir.
Abstract
Fonksiyonel tamamlama deneyi (FCA), yaygın olarak genler / enzimlerin fonksiyonu / rolünü açıklamak için kullanılan bir in vivo deneydir. Bu teknik biyokimya, genetik ve diğer birçok bilim dallarında çok yaygındır. tekniğin kapsamlı bir bakış peptidoglikan ve bakteriyel sıkı yanıt Bu yazıda bildirilen asitleri, amino ilgili biyokimyasal yolların öğretilmesini tamamlamak için. Lisin (D, L-diaminopimelat aminotransferaz (dapL) ve tirosin ve fenilalanin metabolizmasına katılan tirosin aminotransferaz (tyrB) metabolizmasında rol oynayan modeli bitki organizma Arabidopsis thaliana iki cDNA'lar vurgulanır. Buna ek olarak, bakteriyel peptidoglikan anabolik yolu ortada yer alan bir bakteri Verrucomicrobium spinosum gelen UDP- N -acetylmuramoyl-L-alanil-D-glutamat mezo -2,6-diaminopimelat ligaz (MURE) geninin analizi ile vurgulanırpeptidoglikan -linking. Bakteriyel sıkı yanıt da. Rsh (r ela / s Pot h omolog) bakteri Novosphingobium sp bir hiper-sümüksü fenotip sorumlu çift işlevli gen analizi ile bildirilen FCA dört örnekleri sunulmaktadır. Video yani lisin, peptidoglikan ve sıkı tepki, üçü üzerinde durulacak.
Introduction
Bir genin işlev (ler) açıklık / rol (ler) bağlamında fonksiyonel tamamlama homolog doğal tipte durumuna gözlemlenebilir fenotip ile belirli bir mutant geri belirli bir homolog ya da ortolog genin yeteneği olarak tanımlanır veya orthologous gen mutant arka plana cis veya trans tanıtıldı. Bu teknik yaygın izole ve işlev (ler) birçok genin / rolü (ler) tanımlamak için kullanılır olmuştur. Bir özel örnek olarak S. URA3 kullanılarak Candida albicans arasından orotidin-5-fosfat dekarboksilaz izolasyon ve tanımlanmasıdır S. cerevisiae ve E. pyrF mutant E. coli. 1 Yazarlar amino asitler, peptidoglikan ve araştırma programlarına sıkı yanıtın metabolizmasında rol alır ve B öğretim programlarına bu tekniği dahil olan genlerin işlevini aydınlatmak için bu tekniği kullandıkiotechnology ve Moleküler Bioscience (BMB) Rochester Institute of Technology (RIT) program.
İlkeleri ve Uygulamaları (BPP) (Hudson / Savka), RIT BMB Programı iki üst bölümü seçmeli laboratuar tabanlı dersler: Yazarlar Bitki Biyokimyası / Patoloji (FPBP) (Hudson) ve Biyoseparasyonlara temelleri öğretmek. derslerde ele alınmaktadır konuların bazıları araştırma alanları ile bağlı olduğundan, yazarlar bu iki laboratuar tabanlı derslerin içine kendi araştırma programlarında kullanılan teknikler ve deneysel araçları birçok dahil etmişlerdir. Böyle bir örnek bitkiler, peptidoglikan ve bakterilerden sıkı yanıt metabolizma asit metabolizmasını amino ilgili ders materyallerini güçlendirmek için bir laboratuvar egzersiz fonksiyonel tamamlama olduğunu.
FPBB ders açıklanan bitkilerden amino asit yollarının üç olduğu lisin (Lys) arasında, tirosin(Tyr) ve fenilalanin (Phe). Hayvanlar lys de novo sentez genetik makine yoksun beri lys yolu nedeniyle tüm hayvanlar, özellikle insanlarda için temel bir amino asit gibi amino asitin önemi sırasında vurgulanır. Buna ek olarak, son zamanlarda bitkilerin bakteri önemli ölçüde farklı olan Lys sentezi için bir yol kullanılması olduğu keşfedilmiştir. Bu buluş, kısmen, E. fonksiyonel komplemantasyon ile kolaylaştırıldı E. coli diaminopimelat (DAP) model bitki Arabidopsis thaliana enzim L L-diaminopimelat aminotransferaz (DapL) kodlayan bir gen kullanılarak mutantlar. Ara madde 2 diaminopimelat, Lys sentezi için varyant yolları, Şekil 1 'de gösterilmiştir. Buna ek olarak , lys sentezi çok düzenlenir amino asitler aspartat türetilmiş ailesi aracılığıyla kolaylaştırır. 3 protein synt önemleri ek olaraknüklerde, Tyr ve Phe'den için yollar fenilpropanoid bileşiklerin anabolizmasında öncül bileşikler olarak hizmet veren önemlerini gibi bitki savunma bileşiklerin sentezi dahil verilen vurgulanmış almaktadır. alkaloidler, lignin, flavonoidler, isoflavonoitlerin, diğerleri arasında hidroksisinnamik asit 4 tyr ve phe yolları da bitki ve bakteriyel anabolik yollar arasındaki farkı göstermek için vurgulanır. Bitkilerde, enzim, Tyr ve Phe'den katabolizması esas olarak dahil olup, bu amino asitler anabolizma dahil değildir ise bakteriler, enzim tirosin aminotransferaz (TyrB), her iki amino asit anabolizma yer almaktadır. (Şekil 2). 4
Gram pozitif ve Gram peptidoglikan (PG) yapısına ilişkin negatif bakteriler arasındaki farklar FPBP ders vurgulanır. Gram negatif bakterilerin PG aslında dayalı bitki patolojisi ile ilgili ilgi çoğu obitki patojenleri Gram negatif bulunmaktadır. ilk 10 bakteriyel bitki patojenleri ile ilgili yeni bir yorum tüm Gram negatif olduğunu ortaya koymuştur. Bakteri cinslerden edildi. Pseudomonas, Ralstonia, Agrobacterium, Xanthomonas, Erwinia, Xylella, Dickeya ve Pectobacterium kimyasal farklılıkları 5 bir Gram negatif ve Gram pozitif bakterilere PG kök karşılaştırırken çapraz bağlama amino arasındaki farktır Her iki tip asitlerdir. PG farklı çapraz-bağlanması için, ilk aşama PG anabolizma sitoplazmik aşamada gerçekleşir ve enzim UDP- N -acetylmuramoyl-L-alanil-D-glutamat mezo -2,6-diaminopimelat ligaz ile kolaylaştırılır (MURE) (Şekil 3A). MURE çok Gram negatif bakteriler peptit sapının üçüncü konum. 6 da, belirli bir diamin bileşiğinin eklenmesini katalize sondan bir önceki Lys (, mezo -diaminopimelate öncülü <em> m -DAP) olarak görev yapan çapraz bağlama amino asidi ve Lys çoğu Gram pozitif bakterilerin PG (Şekil 3B) aynı rol oynar. 7, bu m -DAP ve Lys her iki amin sahip olmasından kaynaklanmaktadır gruplar ve peptit, kök çapraz bağlanma için iki peptid bağlar oluşturabilirler.
Biyoseparasyonlara in: Principles and Practices (BPP) kursu nedeniyle çevresel değişikliklere bakteri ekimi ve nasıl besin düzeyleri her iki sistemde de önemli ölçüde değişecek açık ve kapalı sistemler arasındaki farklar tartışılır. Bu olaylar bir "aşağı kayması" veya "shift" olarak adlandırılan düzenleyici değişiklikler ile bağlantılı açlık ya da amino asitler ya da enerji yeterli kaynağı tarafından tetiklenen. Bir bakteri kültürü, tek bir karbon kaynağı ile kimyasal olarak tanımlanmış orta zengin ve karmaşık ortamından transfer edildiğinde "vites" yanıtı oluşabilir. ortamda bu değişiklik hızlı Cessa yol açartRNA ve rRNA sentezi yon. amino asit biyosentezi upregüle halde ribozomlar, protein ve DNA sentezinin eksikliği Bu bırakma sonuçları.
"Vites" yanıtın ardından, mevcut ribozomlar orta ya da çevrede artık mevcut amino asitleri sentezlemek için yeni enzimler üretmek için kullanılır. Bir süre sonra, rRNA sentezi ve yeni ribozom monte edilir ve bakteriyel hücre popülasyonu daha az bir oranda olmakla birlikte büyümeye başlar. Olayların ders "sıkı tepki" ya da "sıkı denetim" olarak adlandırılan ve küresel hücresel düzenlemenin bir örneğidir ve gerekli yüzeylerde ve enerji ihtiyacının durumu telafi etmek için hücrenin biyosentetik makine ayarlamak için bir mekanizma olarak düşünülebilir edilir . 8 sıkı tepkisi dolayısıyla çevrede besin akıları hızla yanıt bakteri sağlayan ve katkıda bulunur ve enhbesin ve veya substrat kullanılabilirliği açısından hızla değiştirebilirsiniz ortamlarda rekabet bakterilerin yeteneğini MANOTOP'la. 8-9
Katı yanıtı amino asitler, karbon, azot, fosfat ve yağlı asitlerin mevcudiyeti sınırlıdır gen ekspresyonunda bir rol vardır. 8,10-14 Bu katı tepkisi iki nükleotid guanosin tetrafosfat (ppGpp) ve guanosin tarafından koordine edilir pentafosfat (pppGpp) genellikle alarmone (p) ppGpp olarak birlikte anılacaktır. Örneğin, amino asitler sınırlı olan zaman, guanosin 3-difosfat 5-trifosfatın anabolizma türetilen guanosin 3,5- (bis) pirofosfat (ppGpp), (pppGpp) biriken protein sentezini-alarmone bir darboğaz yol açabilir hücresinde. (P) ppGpp seviyesindeki değişiklik, doğrudan hücre büyümesi ve developmen katılan ortamında alt-tabakaların eksikliğinin üstesinden gelmek üzere yanıt düzenleyen genlerin ifadesi ile ilgilidirt. Bu süreçte yer alan genlerin ikisi rela ve spoT denir. RelA amino asit sınırlama sonucudur yüksüz tRNA'ların birikimine cevap olarak dahil olan bir ribozom ile ilişkili (p) ppGpp sentetaz olup. bir iki fonksiyonlu (p) ppGpp sentetaz ve hidrolaz spot çalışır. Spot sentetaz aktivitesi karbon ve yağ asidi açlık eksikliği yanıt yer almaktadır. RelA / Spot homologları bitkilerde ve bakterilerde yaygın ve R ELA / S Pot h omologs için RSH olarak adlandırılır 8. 8,10 -12,16 yeni bir el yazması bir bakteri Novosphingobium sp Rr 2-17 bu alarmones sentezinde yer alan belirli bir Rsh proteini olduğunu göstermiştir. 17
Burada fonksiyonel tamamlama deneyleri gergin dört biyokimyasal yollar sunuyoruz. Bu yazıda belirtilen tamamlama deneyleri expl bir yol sağlarcevher bilinmeyen / varsayılan işlev (ler) ya da eğitim araçları biyokimyasal yolların öğretilmesini tamamlamak için sahip olduğu tahmin edilir enzimleri belirlenmesi ve ya karakterize bir araç olarak bu in vivo deney istihdam.
Protocol
Representative Results
Discussion
Rochester Teknoloji Enstitüsü'nde Biyoteknoloji ve Moleküler Bioscience müfredat ayrılmaz bir parçası olan derslerin çoğu dersin ders kısmına ek olarak laboratuvar bileşeni var. akademik yıl 2014-2015 için müfredat yaklaşık% 60'ını temsil eden bir laboratuvar bileşeni içeren 29 olan 48 ders, toplam içerir. İlkeleri ve Uygulamaları (BPP), bir laboratuvar bazlı ders: Böyle bir ders Bitki Biyokimya ve Patoloji (FPBP), bir harmanlanmış ders / laboratuvar ders ve Biyoseparasyonlara temelle…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
AOH ve MAS Bilim Koleji ve destek için Rochester Teknoloji Enstitüsü'nde Yaşam Bilimleri Thomas H. Gosnell Okulu kabul eder. Bu çalışma Amerika Birleşik Devletleri Ulusal Bilim Vakfı (NSF) AOH MCB-1120541 için ödül tarafından kısmen desteklenmiştir.
Materials
| E. coli mutants | Hudson/Savka lab or CGSC (http://cgsc.biology.yale.edu/) | |
| Electroporator | Biorad-USA | 1652100 |
| Electroporation Cuvettes | Biorad-USA | 1652082 |
| Temperature controlled incubator | Generic | |
| Microcentrifuge | Generic | |
| Luria Agar | Thermofisher Scientific | 22700025 |
| Luria Broth | Thermofisher Scientific | 12795084 |
| M9 Medium | Sigma-Aldrich | 63011 |
| Potato Dextrose Medium | Fisher Scientfic | DF0013-15-8 |
| Kanamycin | Sigma-Aldrich | K1377 |
| Diaminopimelate | Sigma-Aldrich | 92591 |
| Thymine | Sigma-Aldrich | T0376 |
| Chloramphenicol | Sigma-Aldrich | C0378 |
| Tyrosine | Sigma-Aldrich | T3754 |
| Phenlylalanine | Sigma-Aldrich | P2126 |
| Aspartate | Sigma-Aldrich | A9256 |
| Valine | Sigma-Aldrich | V0500 |
| Leucine | Sigma-Aldrich | L8000 |
| Isoleucine | Sigma-Aldrich | I2752 |
| Uracil | Sigma-Aldrich | U0750 |
| Gylcerol | Sigma-Aldrich | G5516 |
| Arabinose | Sigma-Aldrich | A3256 |
| Tetracyline | Sigma-Aldrich | 87128 |
| Taq DNA polymerase | Thermofisher Scientific | 10342-020 |
| Platinum pfx DNA polymerase | Thermofisher Scientific | 11708-013 |
| T4 DNA ligase | Thermofisher Scientific | 15224-041 |
| E coli Dh5-alpha | Thermofisher Scientific | 18258012 |
| E coli Top10 | Thermofisher Scientific | C4040-03 |
| pET100D/topo vector | Thermofisher Scientific | K100-01 |
| pCR2.1 Vector | Thermofisher Scientific | K2030-01 |
Referenzen
- Gillum, A. M., Tsay, E. Y., Kirsch, D. R. Isolation of the Candida albicans gene for orotidine-5′-phosphate decarboxylase by complementation of S. cerevisiae ura3 and E. coli pyrF mutations. Mol Gen Genet. 198, 179-182 (1984).
- Hudson, A. O., Singh, B. K., Leustek, T., Gilvarg, C. An L,L-diaminopimelate aminotransferase defines a novel variant of the lysine biosynthesis pathway in plants. Plant Physiol. 140, 292-301 (2006).
- Jander, G., Joshi, V., Last, R. L. Aspartate-derived amino acid biosynthesis in Arabidopsis thaliana. The Arabidopsis Book. , (2009).
- Prabhu, P., Hudson, A. O. Identification and partial characterization of an L-Tyrosine aminotransferase from Arabidopsis thaliana. Biochemistry Research International. , 549572 (2010).
- Mansfield, J., Genin, S., Magori, S., Citovsky, V., Sriariyanum, M., Ronald, P., Dow, M., Verdier, V., Beer, S. V., Machado , M. A., Toth, I., Salmond, G., Foster, G. D. Top 10 pathogenic bacteria in molecular pathology. Molecular Plant Pathology. 13, 614-629 (2012).
- McGroty, S. E., Pattaniyil, D. T., Patin, D., Blanot, D., Ravichandran, A. C., Suzuki, H., Dobson, R. C., Savka, M. A., Hudson, A. O. Biochemical Characterization of UDP-N-acetylmuramoyl-L-alanyl-D-glutamate: meso-2,6-diaminopimelate ligase (MurE) from Verrucomicrobium spinosum DSM 4136T. PLoS ONE. 8 (6), e66458 (2013).
- Hutton, C. A., Perugini, M. A., Gerrard, J. A. Inhibition of lysine biosynthesis: an evolving antibiotic strategy. Mol Biosyst. 3, 458-465 (2007).
- Potrykus, K., Cashel, M. (p)ppGpp: still magical. Annu Rev Microbiol. 62, 35-51 (2008).
- Dalebroux, Z. D., Svensson, S. L., Gaynor, E. C., Swanson, M. S. ppGpp Conjures Bacterial Virulence. Microbiology and Molecular Biology Reviews. 74, 171-199 (2010).
- Cashel, M., Gentry, D. J., Hernandez, V. J., Vinella, D., Neidhardt, F. C., Curtiss, R., Ingraham, J. L., Lin, E. C. C., Low, K. B., Magasanik, B., Reznikoff, W. S., Riley, M., Schaechter, M., Umbarger, H. E. The stringent response. Escherichia coli and Salmonella typhimurium: cellular and molecular biology. , 1458-1496 (1996).
- Chatterji, D., Ojha, A. K. Revisiting the stringent response, ppGpp and starvation signaling. Curr. Opin. Microbiol. 4, 160-165 (2001).
- Jain, V., Kumar, M., Chatterji, D. ppGpp: stringent response and survival. J. Microbiol. 44, 1-10 (2006).
- Kramer, G. F., Baker, J. C., Ames, B. N. Near-UV stress in Salmonella typhimurium: 4-thiouridine in tRNA, ppGpp, and pppGpp as components of an adaptive response. J. Bacteriol. 170, 2344-2351 (1988).
- Braeken, K., Moris, M., Daniels, R., Vanderleyden, J., Michiels, J. New horizons for (p)ppGpp in bacterial and plant physiology. Trends Microbiol. 14, 45-54 (2006).
- Joseleau-Petit, D., Vinella, D., D’Ari, R. Metabolic alarms and cell division in Escherichia coli. J. Bacteriol. 181, 9-14 (1999).
- Mittenhuber, G. Comparative genomics and evolution of genes encoding bacterial (p) ppGpp synthetases/hydrolases (the Rel, RelA, and SpoT proteins). J. Mol. Microbiol. Biotechnol. 3, 585-600 (2001).
- Gan, H. M., Buckley, L., Szegedi, E., Hudson, A. O., Savka, M. A. Identification of an rsh Gene from a Novosphingobium sp. Necessary for Quorum-Sensing Signal Accumulation. J. Bacteriol. 191, 2551-2560 (2009).
- Nachar, V. R., Savka, F. C., McGroty, S. E., Donovan, K. A., North, R. A., Dobson, R. C., Buckley, L. J., Hudson, A. O. Genomic and biochemical analysis of the diaminopimelate and lysine biosynthesis pathway in Verrucomicrobium spinosum: Identification and partial characterization of L,L-diaminopimelate aminotransferase and UDP-N-acetylmuramoylalanyl-D-glutamyl-2,6-meso-diaminopimelate ligase. Front. Microbiol. 3, 183 (2012).
- Hudson, A. O., Giròn, I., Dobson, R. C. J. Crystallization and preliminary X-ray diffraction analysis of L,L-diaminopimelate aminotransferase (DapL) from Chlamydomonas reinhardtii. Acta Cryst. 67, 140-143 (2011).
- Dobson, R. C. J., Gir òn, I., Hudson, A. O. L,L-Diaminopimelate Aminotransferase from Chlamydomonas reinhardtii: A Target for Algaecide Development. PLoS ONE. 6 (5), e20439 (2011).
- Guzman, L. M., Belin, D., Carson, M. J., Beckwith, J. Tight regulation, modulation, and high-level expression by vectors containing the arabinose pBAD promoter. J. Bacteriol. 177, 4121-4130 (1995).
- Sambrook, J., Russell, D. W. . Molecular Cloning: A laboratory manual. , (2001).
- Lugtenberg, E. J., van Schijndel-van Dam, A. Temperature-sensitive mutants of Escherichia coli K-12 with low activity of the diaminopimelic acid adding enzyme. J. Bacteriol. 110, 41-46 (1972).
- Mavrides, C., Orr, W. Multispecific aspartate and aromatic amino acid aminotransferases in Escherichia coli. J. Biol Chem. 250, 4128-4133 (1975).
- Gelfand, D. H., Steinberg, R. A. Escherichia coli mutants deficient in the aspartate and aromatic amino acid aminotransferases. J. Bacteriol. 130, 429-440 (1977).
- Whitaker, R. J., Gaines, C. G., Jensen, R. A. A multispecific quintet of aromatic aminotransferases that overlap different biochemical pathways in Pseudomonas aeruginosa. J. Biol Chem. 257, 13550-13556 (1982).
- Raskin, D. M., Judson, N., Mekalanos, J. J. Regulation of the stringent response in the essential function if the conserved bacterial G protein CgtA in Vibrio cholera. Proc Natl Acad Sci, USA. 104, 4636-4641 (2007).
- Ditta, G., Stanfield, S., Corbin, D., Helinski, D. R. Broad host range DNA cloning system for Gram-negative bacteria: construction of a gene bank of Rhizobium meliloti. Proc Natl Acad Sci, USA. 77, 7347-7351 (1980).
- Watanabe, A., Suzuki, M., Ujiie, S., Gomi, K. Purification and enzymatic characterization of a novel β-1,6-glucosidase from Aspergillus oryzae. J Biosci Bioeng. , (2015).
- Song, J. T., Lu, H., McDowell, J. M., Greenberg, J. T. A key role for ALD1 in activation of local and systemic defenses in Arabidopsis. Plant J. 40, 200-212 (2004).
- Rost, B., Liu, J., Nair, R., Wrzeszczynski, K. P., Ofran, Y. Automatic prediction of protein function. Celuular and Molecular Life Sciences. 60, 2637-2650 (2003).
- Norris, S. R., Shen, X., Penna, D. D. Complementation of the Arabidopsis pds1 mutation with the gene encoding p-Hyrdoxyphenylpyruvate dioxygenase. Plant Physiol. 117, 1317-1323 (1998).
- Mohler, W. A., Blau, H. M. Gene expression and cell fusion analyzed by lacZ complementation in mammalian cells. Proc Natl Acad Sci, USA. 93, 12423-12427 (1996).
