Functionele Complementatie Analysis (FCA): A Laboratory Oefening ontworpen en geïmplementeerd om het onderwijs in Biochemical Pathways Supplement
Summary
De validatie van de enzymatische activiteiten die betrokken zijn bij biochemische pathways kunnen worden toegelicht met behulp van functionele complementatie analyse (FCA). In dit manuscript het FCA assay waaruit de enzymatische activiteit van enzymen betrokken bij het metabolisme van aminozuren, bacteriële stringente respons en bacteriële peptidoglycaan biosynthese.
Abstract
Functionele complementatie bepaling (FCA) een in vivo analyse die op grote schaal wordt gebruikt om de functie / rol van genen / enzymen helderen. Deze techniek is heel gebruikelijk in de biochemie, genetica en vele andere disciplines. Een uitgebreid overzicht van de techniek om de leer van biochemische routes met betrekking tot zuren, peptidoglycaan en de bacteriële strenge reactie wordt beschreven in dit manuscript aminozuren aan te vullen. Twee cDNA's van de modelplant Arabidopsis thaliana die betrokken zijn bij het metabolisme van lysine (L, L-diaminopimelinezuur aminotransferase (dapL) en tyrosine aminotransferase (tyrB) betrokken bij het metabolisme van tyrosine en fenylalanine zijn gemarkeerd. Daarnaast is de bacteriële peptidoglycaan anabolische route gemarkeerd door de analyse van de UDP-N -acetylmuramoyl-L-alanyl-D-glutamaat -2,6 meso-diaminopimelinezuur ligase (Muré) gen uit het bacterie Verrucomicrobium spinosum betrokken bij het kruis-linking van peptidoglycan. De bacteriële stringente respons wordt eveneens opgenomen in de analyse van de rsh (r ElA / s pot h omolog) bifunctionele gen betrokken bij een hyper-mucoïde fenotype van de bacterie Novosphingobium sp. Vier voorbeelden van FCA worden gepresenteerd. De video zal zich richten op drie van hen, namelijk lysine, peptidoglycaan en de strenge reactie.
Introduction
Functionele complementatie in de context van het ophelderen van de functie (s) / functie (s) van een gen wordt gedefinieerd als het vermogen van een bepaalde homoloog of ortholoog gen een bepaalde mutant renovatie met een waarneembaar fenotype met het wild-type toestand wanneer de homologe of orthologe gen wordt ingebracht in cis- of trans in het mutante achtergrond. Deze techniek wordt algemeen gebruikt voor het isoleren en de functie (s) / functie (s) van vele genen. Een specifiek voorbeeld is de isolatie en identificatie van orotidine-5-fosfaat decarboxylase van Candida albicans met de ura3 mutant van S. cerevisiae en pyrF mutant van E. coli. 1 De auteurs hebben deze techniek gebruikt om de functie van genen die betrokken zijn bij het metabolisme van aminozuren, peptidoglycaan en de stringente respons in hun onderzoeksprogramma's en deze techniek hebben omgezet leerplannen B heldereniotechnology en Moleculair Biologische (BMB) programma aan het Rochester Institute of Technology (RIT).
De auteurs leren Fundamentals of Plant Biochemistry / Pathology (FPBP) (Hudson) en Bioseparations: Principles and Practices (BPP) (Hudson / Savka), twee bovenste divisie keuzevakken laboratorium op basis van cursussen in de BMB Program aan de RIT. Aangezien enkele van de onderwerpen die aan bod komen in de cursussen worden aangesloten bij hun onderzoek belangen zijn de auteurs veel van de technieken en experimentele instrumenten die gebruikt worden in hun onderzoeksprogramma's in deze twee-laboratorium op basis van cursussen opgenomen. Een voorbeeld is functionele complementatie als laboratorium oefening om de lezing materialen met betrekking tot zuurmetabolismeblokkers uit planten, peptidoglycaan en de stringente respons metabolisme van bacteriën amino versterken.
Drie van de aminozuur paden uit planten die worden beschreven in de FPBB Natuurlijk zijn die lysine (Lys), tyrosine(Tyr) en fenylalanine (phe). De lys route wordt gemarkeerd in de loop vanwege het belang van het aminozuur als een essentieel aminozuur voor alle dieren bijzonder mensen omdat de dieren missen de genetische machinerie te synthetiseren Lys de novo. Bovendien werd recent ontdekt dat planten gebruiken een route voor de synthese van lys die aanzienlijk verschilt van die van bacteriën. Deze ontdekking werd gedeeltelijk vergemakkelijkt door functionele complementatie van E. coli diaminopimelinezuur (dap) mutanten met een gen dat het enzym L, L-diaminopimelinezuur aminotransferase (DapL) codeert de modelplant Arabidopsis thaliana. 2 De variant wegen voor de synthese van lys door de tussenliggende diaminopimelinezuur zijn weergegeven in figuur 1. Naast de synthese van lys vergemakkelijkt door het aspartaat afgeleide familie van aminozuren die sterk gereguleerd. 3 Naast hun belang eiwitten Synthesis de routes voor Tyr en Phe zijn gemarkeerd gezien hun belang dienen als voorloperverbindingen voor het anabolisme van phenylpropanoid verbindingen omvatte de synthese van plantaardige afweerstoffen voorzien:. alkaloïden, ligninen, flavonoïden, isoflavonen, hydroxykaneelzuur oa 4 De tyr en phe trajecten worden ook gewezen op het verschil tussen de plant en bacteriële anabole pathways te tonen. In bacteriën wordt het enzym tyrosine aminotransferase (tyrB) betrokken bij het anabolisme van beide aminozuren, terwijl in planten, het enzym primair betrokken bij de afbraak van tyr phe en en niet betrokken bij het anabolisme van deze aminozuren. (Figuur 2). 4
De verschillen tussen Gram positieve en Gram negatieve bacteriën over de inrichting van peptidoglycaan (PG) zijn aangegeven in de FPBP loop. De PG van Gram negatieve bacteriën is van belang op plantenpathologie gebaseerd op het feit dat de meesteplantpathogenen zijn Gram-negatieve. Een recente beoordeling met betrekking tot de top 10 bacteriële fyto-pathogenen bleek dat alle zijn Gram-negatieve. De bacteriën werden uit de genera:. Pseudomonas, Ralstonia, Agrobacterium, Xanthomonas, Erwinia, Xylella, Dickeya en Pectobacterium 5 Een van de chemische verschillen bij vergelijking van de PG stam van Gram-negatieve en gram-positieve bacteriën is het verschil tussen de verknopende amino zuren van beide types. De eerste stap voor die verschillende verknoping van PG optreedt in de stap van het cytoplasmatische PG anabolisme en wordt vergemakkelijkt door het enzym UDP-N -acetylmuramoyl-L-alanyl-D-glutamaat -2,6 meso-diaminopimelinezuur ligase (MURE) (Figuur 3A). Mure katalyseert de toevoeging van een bepaalde diamineverbinding ten derde positie van het peptide steel. 6 in de meeste Gram-negatieve bacteriën, de voorlaatste lys voorloper, meso -diaminopimelate ( <em> m -DAP) dient als verknoping aminozuur en lys vervult dezelfde rol in de PG meeste gram-positieve bacteriën (Figuur 3B). 7 Dit komt door het feit dat zowel m -DAP lys en bezitten twee amine groepen kunnen vormen twee peptidebindingen voor peptide stam verknoping.
In de Bioseparations: Principles and Practices (BPP) Uiteraard zijn de verschillen tussen open en gesloten systemen voor de teelt van bacteriën en hoe nutriëntenniveaus aanzienlijk zal veranderen in beide systemen als gevolg van veranderingen in het milieu besproken. Deze gebeurtenissen zijn gekoppeld aan wijzigingen in de regelgeving een zogenaamde "terugschakelen" of "opschakelen" veroorzaakt door honger of een voldoende aanbod van aminozuren of energie. De "terugschakelen" reactie kan optreden als een bacteriële kweek wordt overgebracht van een rijk en complex medium om een chemisch gedefinieerde medium met een enkele koolstofbron. Deze verandering in de omgeving leidt tot de snelle Cessatie van tRNA en rRNA synthese. Deze beëindiging leidt het gebrek aan ribosomen, eiwit- en DNA-synthese, hoewel de biosynthese van aminozuren opgereguleerd.
Naar aanleiding van de "terugschakelen" reactie, worden de bestaande ribosomen gebruikt om nieuwe enzymen produceren om de aminozuren niet meer beschikbaar in het medium of milieu te synthetiseren. Na een periode van tijd, rRNA synthese en nieuwe ribosomen worden geassembleerd en de populatie van bacteriële cellen begint te groeien, hoewel tegen een gereduceerd tarief. De gang van zaken wordt genoemd de "stringente respons" of "stringente controle" en is een voorbeeld van de wereldwijde cellulaire regulatie en kan worden gezien als een mechanisme voor het aanpassen van de cel biosynthetische machinerie ter compensatie van de beschikbaarheid van de vereiste substraten en energiebehoeften . 8 de strenge reactie stelt dus bacteriën om snel te reageren op fluxen van nutriënten in het milieu en draagt en enhraten het vermogen van bacteriën om te concurreren in een omgeving die snel kunnen veranderen met betrekking tot voedings- en of substraat beschikbaarheid. 8-9
De stringente respons een integrale rol in genexpressie wanneer de beschikbaarheid van aminozuren, koolstof, stikstof, fosfaat en vetzuren beperkt. 8,10-14 Deze stringente respons wordt gecoördineerd door twee nucleotiden, guanosine tetrafosfaat (ppGpp) en guanosine pentaphosphate (pppGpp) meestal aangeduid samen als de alarmoon (p) ppGpp. Wanneer bijvoorbeeld aminozuren beperkte die kan leiden tot een knelpunt in de eiwitsynthese-alarmoon, guanosine 3,5- (bis) pyrofosfaat (ppGpp), afgeleid van anabolisme van guanosine 3-difosfaat 5-trifosfaat (pppGpp) accumuleert in de cel. De verandering in (p) ppGpp level is betrokken bij expressie van genen die de respons te om het gebrek aan substraten in de omgeving die direct betrokken zijn bij celgroei en -ontwikkeling overwinnent. Twee van de genen die betrokken zijn bij dit proces heten Rela en spot. RelA een ribosoom-geassocieerde (p) ppGpp synthetase dat betrokken is bij de reactie op de accumulatie van ongeladen tRNA's die het resultaat is van beperking aminozuur. SPOT functioneert als een bifunctioneel (p) ppGpp synthetase en hydrolase. De synthetase activiteit van SPOT is betrokken bij de reactie op het gebrek aan koolstof en vetzuur verhongering. 8 de RelA / Spot homologen zijn wijdverspreid in planten en bacteriën en worden aangeduid als Rsh O ElA / S POT h omologs. 8,10 -12,16 een recent manuscript aangetoond dat er een specifiek Rsh eiwit betrokken bij de synthese van deze alarmones uit de bacterie Novosphingobium sp Rr 2-17. 17
Hier presenteren we vier biochemische pathways vastgebonden aan de functionele complementatie bepalingen. De complementering assays beschreven in dit manuscript biedt een laan naar EXPLerts toepassing van deze in vivo analyse als middel voor het identificeren en karakteriseren of enzymen die worden voorspeld onbekende / mogelijke functie (s) of leermiddelen de leer van biochemische pathways aanvulling hebben.
Protocol
Representative Results
Discussion
Veel van de cursussen die integraal zijn voor de Biotechnologie en Moleculaire Bioscience curriculum aan het Rochester Institute of Technology hebben een laboratorium component in aanvulling op de lezing deel van de cursus. Het curriculum voor het academisch jaar 2014-2015 een totaal van 48 cursussen, waarvan 29 bevatten een laboratorium component die ongeveer 60% vertegenwoordigen. Een van deze cursus is Fundamentals of Plant Biochemie en Pathologie (FPBP), een gemengde lezing / practicum en Bioseparations: Principles …
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
AOH en MAS erkent het College of Science en de Thomas H. Gosnell School of Life Sciences aan het Rochester Institute of Technology voor ondersteuning. Dit werk werd gedeeltelijk ondersteund door de Amerikaanse National Science Foundation (NSF) toe te kennen aan AOH MCB-1120541.
Materials
| E. coli mutants | Hudson/Savka lab or CGSC (http://cgsc.biology.yale.edu/) | |
| Electroporator | Biorad-USA | 1652100 |
| Electroporation Cuvettes | Biorad-USA | 1652082 |
| Temperature controlled incubator | Generic | |
| Microcentrifuge | Generic | |
| Luria Agar | Thermofisher Scientific | 22700025 |
| Luria Broth | Thermofisher Scientific | 12795084 |
| M9 Medium | Sigma-Aldrich | 63011 |
| Potato Dextrose Medium | Fisher Scientfic | DF0013-15-8 |
| Kanamycin | Sigma-Aldrich | K1377 |
| Diaminopimelate | Sigma-Aldrich | 92591 |
| Thymine | Sigma-Aldrich | T0376 |
| Chloramphenicol | Sigma-Aldrich | C0378 |
| Tyrosine | Sigma-Aldrich | T3754 |
| Phenlylalanine | Sigma-Aldrich | P2126 |
| Aspartate | Sigma-Aldrich | A9256 |
| Valine | Sigma-Aldrich | V0500 |
| Leucine | Sigma-Aldrich | L8000 |
| Isoleucine | Sigma-Aldrich | I2752 |
| Uracil | Sigma-Aldrich | U0750 |
| Gylcerol | Sigma-Aldrich | G5516 |
| Arabinose | Sigma-Aldrich | A3256 |
| Tetracyline | Sigma-Aldrich | 87128 |
| Taq DNA polymerase | Thermofisher Scientific | 10342-020 |
| Platinum pfx DNA polymerase | Thermofisher Scientific | 11708-013 |
| T4 DNA ligase | Thermofisher Scientific | 15224-041 |
| E coli Dh5-alpha | Thermofisher Scientific | 18258012 |
| E coli Top10 | Thermofisher Scientific | C4040-03 |
| pET100D/topo vector | Thermofisher Scientific | K100-01 |
| pCR2.1 Vector | Thermofisher Scientific | K2030-01 |
Referenzen
- Gillum, A. M., Tsay, E. Y., Kirsch, D. R. Isolation of the Candida albicans gene for orotidine-5′-phosphate decarboxylase by complementation of S. cerevisiae ura3 and E. coli pyrF mutations. Mol Gen Genet. 198, 179-182 (1984).
- Hudson, A. O., Singh, B. K., Leustek, T., Gilvarg, C. An L,L-diaminopimelate aminotransferase defines a novel variant of the lysine biosynthesis pathway in plants. Plant Physiol. 140, 292-301 (2006).
- Jander, G., Joshi, V., Last, R. L. Aspartate-derived amino acid biosynthesis in Arabidopsis thaliana. The Arabidopsis Book. , (2009).
- Prabhu, P., Hudson, A. O. Identification and partial characterization of an L-Tyrosine aminotransferase from Arabidopsis thaliana. Biochemistry Research International. , 549572 (2010).
- Mansfield, J., Genin, S., Magori, S., Citovsky, V., Sriariyanum, M., Ronald, P., Dow, M., Verdier, V., Beer, S. V., Machado , M. A., Toth, I., Salmond, G., Foster, G. D. Top 10 pathogenic bacteria in molecular pathology. Molecular Plant Pathology. 13, 614-629 (2012).
- McGroty, S. E., Pattaniyil, D. T., Patin, D., Blanot, D., Ravichandran, A. C., Suzuki, H., Dobson, R. C., Savka, M. A., Hudson, A. O. Biochemical Characterization of UDP-N-acetylmuramoyl-L-alanyl-D-glutamate: meso-2,6-diaminopimelate ligase (MurE) from Verrucomicrobium spinosum DSM 4136T. PLoS ONE. 8 (6), e66458 (2013).
- Hutton, C. A., Perugini, M. A., Gerrard, J. A. Inhibition of lysine biosynthesis: an evolving antibiotic strategy. Mol Biosyst. 3, 458-465 (2007).
- Potrykus, K., Cashel, M. (p)ppGpp: still magical. Annu Rev Microbiol. 62, 35-51 (2008).
- Dalebroux, Z. D., Svensson, S. L., Gaynor, E. C., Swanson, M. S. ppGpp Conjures Bacterial Virulence. Microbiology and Molecular Biology Reviews. 74, 171-199 (2010).
- Cashel, M., Gentry, D. J., Hernandez, V. J., Vinella, D., Neidhardt, F. C., Curtiss, R., Ingraham, J. L., Lin, E. C. C., Low, K. B., Magasanik, B., Reznikoff, W. S., Riley, M., Schaechter, M., Umbarger, H. E. The stringent response. Escherichia coli and Salmonella typhimurium: cellular and molecular biology. , 1458-1496 (1996).
- Chatterji, D., Ojha, A. K. Revisiting the stringent response, ppGpp and starvation signaling. Curr. Opin. Microbiol. 4, 160-165 (2001).
- Jain, V., Kumar, M., Chatterji, D. ppGpp: stringent response and survival. J. Microbiol. 44, 1-10 (2006).
- Kramer, G. F., Baker, J. C., Ames, B. N. Near-UV stress in Salmonella typhimurium: 4-thiouridine in tRNA, ppGpp, and pppGpp as components of an adaptive response. J. Bacteriol. 170, 2344-2351 (1988).
- Braeken, K., Moris, M., Daniels, R., Vanderleyden, J., Michiels, J. New horizons for (p)ppGpp in bacterial and plant physiology. Trends Microbiol. 14, 45-54 (2006).
- Joseleau-Petit, D., Vinella, D., D’Ari, R. Metabolic alarms and cell division in Escherichia coli. J. Bacteriol. 181, 9-14 (1999).
- Mittenhuber, G. Comparative genomics and evolution of genes encoding bacterial (p) ppGpp synthetases/hydrolases (the Rel, RelA, and SpoT proteins). J. Mol. Microbiol. Biotechnol. 3, 585-600 (2001).
- Gan, H. M., Buckley, L., Szegedi, E., Hudson, A. O., Savka, M. A. Identification of an rsh Gene from a Novosphingobium sp. Necessary for Quorum-Sensing Signal Accumulation. J. Bacteriol. 191, 2551-2560 (2009).
- Nachar, V. R., Savka, F. C., McGroty, S. E., Donovan, K. A., North, R. A., Dobson, R. C., Buckley, L. J., Hudson, A. O. Genomic and biochemical analysis of the diaminopimelate and lysine biosynthesis pathway in Verrucomicrobium spinosum: Identification and partial characterization of L,L-diaminopimelate aminotransferase and UDP-N-acetylmuramoylalanyl-D-glutamyl-2,6-meso-diaminopimelate ligase. Front. Microbiol. 3, 183 (2012).
- Hudson, A. O., Giròn, I., Dobson, R. C. J. Crystallization and preliminary X-ray diffraction analysis of L,L-diaminopimelate aminotransferase (DapL) from Chlamydomonas reinhardtii. Acta Cryst. 67, 140-143 (2011).
- Dobson, R. C. J., Gir òn, I., Hudson, A. O. L,L-Diaminopimelate Aminotransferase from Chlamydomonas reinhardtii: A Target for Algaecide Development. PLoS ONE. 6 (5), e20439 (2011).
- Guzman, L. M., Belin, D., Carson, M. J., Beckwith, J. Tight regulation, modulation, and high-level expression by vectors containing the arabinose pBAD promoter. J. Bacteriol. 177, 4121-4130 (1995).
- Sambrook, J., Russell, D. W. . Molecular Cloning: A laboratory manual. , (2001).
- Lugtenberg, E. J., van Schijndel-van Dam, A. Temperature-sensitive mutants of Escherichia coli K-12 with low activity of the diaminopimelic acid adding enzyme. J. Bacteriol. 110, 41-46 (1972).
- Mavrides, C., Orr, W. Multispecific aspartate and aromatic amino acid aminotransferases in Escherichia coli. J. Biol Chem. 250, 4128-4133 (1975).
- Gelfand, D. H., Steinberg, R. A. Escherichia coli mutants deficient in the aspartate and aromatic amino acid aminotransferases. J. Bacteriol. 130, 429-440 (1977).
- Whitaker, R. J., Gaines, C. G., Jensen, R. A. A multispecific quintet of aromatic aminotransferases that overlap different biochemical pathways in Pseudomonas aeruginosa. J. Biol Chem. 257, 13550-13556 (1982).
- Raskin, D. M., Judson, N., Mekalanos, J. J. Regulation of the stringent response in the essential function if the conserved bacterial G protein CgtA in Vibrio cholera. Proc Natl Acad Sci, USA. 104, 4636-4641 (2007).
- Ditta, G., Stanfield, S., Corbin, D., Helinski, D. R. Broad host range DNA cloning system for Gram-negative bacteria: construction of a gene bank of Rhizobium meliloti. Proc Natl Acad Sci, USA. 77, 7347-7351 (1980).
- Watanabe, A., Suzuki, M., Ujiie, S., Gomi, K. Purification and enzymatic characterization of a novel β-1,6-glucosidase from Aspergillus oryzae. J Biosci Bioeng. , (2015).
- Song, J. T., Lu, H., McDowell, J. M., Greenberg, J. T. A key role for ALD1 in activation of local and systemic defenses in Arabidopsis. Plant J. 40, 200-212 (2004).
- Rost, B., Liu, J., Nair, R., Wrzeszczynski, K. P., Ofran, Y. Automatic prediction of protein function. Celuular and Molecular Life Sciences. 60, 2637-2650 (2003).
- Norris, S. R., Shen, X., Penna, D. D. Complementation of the Arabidopsis pds1 mutation with the gene encoding p-Hyrdoxyphenylpyruvate dioxygenase. Plant Physiol. 117, 1317-1323 (1998).
- Mohler, W. A., Blau, H. M. Gene expression and cell fusion analyzed by lacZ complementation in mammalian cells. Proc Natl Acad Sci, USA. 93, 12423-12427 (1996).
