Análisis de Complementación funcional (FCA): Un ejercicio de laboratorio diseñado e implementado para Complementar la enseñanza de la bioquímica Pathways
Summary
La validación de las actividades enzimáticas implicadas en las vías bioquímicas se puede elucidar el uso de análisis de complementación funcional (FCA). Se describe en este manuscrito es el ensayo FCA que demuestra la actividad enzimática de las enzimas implicadas en el metabolismo de aminoácidos, estrictas respuesta bacteriana y la biosíntesis de peptidoglicano bacteriano.
Abstract
Ensayo de complementación funcional (FCA) es un ensayo in vivo que se utiliza ampliamente para dilucidar la función / papel de los genes / enzimas. Esta técnica es muy común en la bioquímica, la genética y muchas otras disciplinas. Una visión global de la técnica para complementar la enseñanza de las vías bioquímicas que pertenecen a los aminoácidos, peptidoglicano y la respuesta estrictas bacteriana se informa en este manuscrito. Dos ADNc de la planta modelo thaliana organismo Arabidopsis que están involucrados en el metabolismo de la lisina (L, aminotransferasa-L diaminopimelato (DAPL) y tirosina aminotransferasa (tyrB) que participan en el metabolismo de la tirosina y fenilalanina están resaltados. Además, el peptidoglicano bacteriano vía anabólica se pone de relieve por medio del análisis del gen de UDP-N -acetylmuramoyl-L-alanil-D-glutamato meso -2,6-ligasa diaminopimelato (mûre) de la bacteria Verrucomicrobium spinosum involucrado en la cruz-linking de peptidoglicano. La respuesta estrictas bacteriana También se informa a través del análisis de la rsh (r ela / s Pot h omolog) gen bifuncional responsables de un fenotipo hiper-mucoide en la bacteria Novosphingobium sp., Se presentan cuatro ejemplos de FCA. El vídeo se centrará en tres de ellos, a saber, la lisina, peptidoglicano y la respuesta estrictas.
Introduction
complementación funcional en el contexto de elucidar la función (s) / papel (s) de un gen se define como la capacidad de un homólogo en particular o genes ortólogos para restaurar un mutante particular con un fenotipo observable al estado de tipo salvaje cuando la homóloga o genes ortólogos se introduce en cis o trans en el fondo mutante. Esta técnica se ha utilizado ampliamente para aislar e identificar la función (s) / papel (s) de muchos genes. Un ejemplo particular es el aislamiento y la identificación de orotidina-5-fosfato a partir de Candida albicans usando el mutante ura3 de S. cerevisiae y el mutante pyrF de E. coli. 1 Los autores han utilizado esta técnica para elucidar la función de los genes que están involucrados en el metabolismo de aminoácidos, peptidoglicano y la respuesta estrictas en sus programas de investigación y han incorporado esta técnica en sus programas de enseñanza en el Ba biotecnología y Biociencia Molecular (BMB) programa en el Instituto de Tecnología de Rochester (RIT).
Los autores enseñan Fundamentos de Bioquímica Vegetal / Patología (FPBP) (Hudson) y para Bios: Principios y Prácticas (BPP) (Hudson / Savka), dos cursos basados en la división superior de laboratorio de elección en el Programa de BMB en el RIT. Dado que algunos de los temas que se tratan en los cursos están afiliados a sus intereses de investigación, los autores han incorporado muchas de las técnicas y herramientas experimentales que se utilizan en sus respectivos programas de investigación en estos dos cursos basados en laboratorio. Un ejemplo es la complementación funcional como un ejercicio de laboratorio para reforzar los materiales de clase pertenecientes a metabolismo de aminoácidos de las plantas, peptidoglicano y el riguroso metabolismo respuesta de bacterias.
Tres de las vías de aminoácidos de las plantas que se tratan en el curso FPBB son la de lisina (Lys), tirosina(Tyr) y fenilalanina (Phe). La vía de lys se pone de relieve en el curso debido a la importancia del aminoácido como un aminoácido esencial para todos los animales particularmente seres humanos ya que los animales carecen de la maquinaria genética para sintetizar lys de novo. Además, recientemente se ha descubierto que las plantas emplean una vía para la síntesis de lys que es significativamente diferente de la de bacterias. Este descubrimiento fue facilitada en parte por complementación funcional de la E. diaminopimelato coli (dap) mutantes utilizando un gen que codifica la enzima L, L-diaminopimelato aminotransferasa (DAPL) de la planta modelo Arabidopsis thaliana. 2 Las vías de variantes para la síntesis de lys a través de la diaminopimelato intermedios se muestran en la Figura 1. Además , la síntesis de lys facilita a través de la familia aspartato derivado de aminoácidos que está altamente regulado. 3 Además de su importancia en synt proteínasHESIS, las vías de Tyr y Phe se destacan por su importancia en servir como compuestos precursores para el anabolismo de compuestos fenilpropanoides involucrados la síntesis de compuestos de defensa de plantas tales como:. alcaloides, ligninas, flavonoides, isoflavonoides, ácido hidroxicinámico entre otros 4 El Tyr y las vías de phe también se destacan para mostrar la diferencia entre la central y las vías anabólicas bacterianas. En las bacterias, la tirosina aminotransferasa enzima (tyrB) está implicado en el anabolismo de ambos aminoácidos, mientras que en las plantas, la enzima es principalmente involucrada en el catabolismo de Tyr y Phe y no está implicado en el anabolismo de estos aminoácidos. (Figura 2). 4
Las diferencias entre las bacterias Gram positivas y Gram negativas con respecto a la estructura de peptidoglicano (PG) se destacan en el curso FPBP. El PG de las bacterias Gram negativas es de interés en relación con la patología de plantas basado en el hecho de que la mayor partepatógenos de las plantas son Gram negativo. Una revisión reciente sobre los 10 fito-patógenos bacterianos reveló que todos son Gram negativas. Las bacterias eran de los géneros:. Pseudomonas, Ralstonia, Agrobacterium, Xanthomonas, Erwinia, Xylella, Dickeya y Pectobacterium 5 Una de las diferencias químicas cuando se compara el vástago de PG de bacterias positivos negativos y Gram es la diferencia entre la reticulación-amino ácidos de ambos tipos. El paso inicial para que diferentes reticulación de PG se produce en la etapa de citoplásmico de PG anabolismo y es facilitado por la enzima UDP-N -acetylmuramoyl-L-alanil-D-glutamato meso -2,6-ligasa diaminopimelato (mûre) (Figura 3A). Mûre cataliza la adición de un compuesto de diamina en particular en tercera posición del vástago de péptido. 6 En la mayoría de las bacterias Gram negativas, las lys penúltimo precursor, -diaminopimelate meso ( <em> m -DAP) sirve como la reticulación de aminoácidos y lys sirve el mismo papel en la PG de la mayoría de las bacterias Gram positivas (Figura 3B). 7 Esto es debido al hecho de que tanto m -DAP y lys poseen dos amina grupos y son capaces de formar dos enlaces peptídicos de tallo péptido reticulación.
En los Bioseparaciones: Principios y Prácticas de golf (BPP), se discuten las diferencias entre sistemas abiertos y cerrados para el cultivo de bacterias y cómo los niveles de nutrientes va a cambiar significativamente en ambos sistemas debido a los cambios ambientales. Estos eventos están vinculados a los cambios de la normativa solicitados un "cambio hacia abajo" o "Desplazamiento hacia arriba" provocados por el hambre o un suministro adecuado de aminoácidos o de energía. La respuesta de "cambio-abajo" puede ocurrir cuando un cultivo bacteriano se transfiere de un medio rico y complejo a un medio químicamente definido con una única fuente de carbono. Este cambio en el medio ambiente conduce a la rápida CESSAla de la síntesis de tRNA y rRNA. Este cese resultado en la falta de ribosomas, proteínas y la síntesis de ADN a pesar de que la biosíntesis de aminoácidos son upregulated.
Tras la respuesta "cambio-abajo", los ribosomas existentes se utilizan para producir nuevas enzimas para la síntesis de los aminoácidos ya no disponibles en el medio o entorno. Después de un período de tiempo, la síntesis de rRNA y nuevos ribosomas son ensamblados y la población de células bacterianas comienza a crecer, aunque a un ritmo reducido. El curso de los acontecimientos que se denomina la "respuesta rigurosas" o "control estricto" y es un ejemplo de la regulación celular global y se puede considerar como un mecanismo para ajustar la maquinaria biosintética de la célula para compensar la disponibilidad de los sustratos requeridos y las necesidades de energía . 8 la respuesta estrictas por lo tanto permite a las bacterias para responder con rapidez a los flujos de nutrientes en el medio ambiente y contribuye y ENHANCES la capacidad de las bacterias para competir en ambientes que pueden cambiar rápidamente con respecto a nutrientes y o la disponibilidad de sustrato. 8-9
La respuesta estrictas tiene un papel integral en la expresión de genes cuando la disponibilidad de aminoácidos, carbono, nitrógeno, fosfato y ácidos grasos son limitadas. 8,10-14 Esta respuesta estrictas está coordinado por dos nucleótidos, tetrafosfato de guanosina (ppGpp) y guanosina pentafosfato (pppGpp) conoce comúnmente como el conjunto alarmone (p) ppGpp. Por ejemplo, cuando los aminoácidos están limitadas-que puede conducir a un cuello de botella en la síntesis de proteínas-la alarmone, guanosina 3,5- (bis) pirofosfato (ppGpp), derivado de anabolismo de guanosina 3-difosfato 5-trifosfato (pppGpp) acumula en la célula. El cambio de nivel (p) ppGpp está implicado en la expresión de los genes que regulan la respuesta para superar la falta de sustratos en el entorno que están directamente involucrados en el crecimiento celular y development. Dos de los genes que están involucrados en este proceso son los llamados relA y Spot. De RelA es un (p) ppGpp sintetasa ribosoma-asociado que está implicado en la respuesta a la acumulación de tRNA no cargados que es el resultado de la limitación de aminoácidos. funciones de detectar como un bifuncional (p) ppGpp sintetasa y hidrolasa. La actividad de la sintetasa de la mancha está implicado en la respuesta a la falta de privación de carbono y el ácido graso. 8 Los homólogos de RelA / SPOT se han generalizado en plantas y bacterias, y se conocen como Rsh para R ELA / S POT h omologs 8,10. -12,16 un manuscrito reciente mostró que hay una proteína Rsh específica implicada en la síntesis de estos alarmones de la bacteria Novosphingobium sp Rr 2-17. 17
Aquí presentamos cuatro vías bioquímicas atados a los ensayos de complementación funcional. Los ensayos de complementación descritos en este manuscrito ofrece una vía para explmineral de empleo de este ensayo in vivo como medio de identificación y caracterización de enzimas o que se predice que tienen función desconocida / putativo (s) o como herramientas de enseñanza para complementar la enseñanza de las rutas bioquímicas.
Protocol
Representative Results
Discussion
Muchos de los cursos que son parte integral del plan de estudios de Biotecnología y Biociencia Molecular en el Instituto de Tecnología de Rochester tienen un componente de laboratorio, además de la parte de lectura del curso. El plan de estudios para el año académico 2014-2015 contiene un total de 48 cursos, 29 de los cuales contienen un componente de laboratorio que representan aproximadamente el 60%. Uno de estos cursos es Fundamentos de Bioquímica Vegetal y Patología (FPBP), un curso mixto clase / laboratorio …
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
AOH y el MAS reconoce la Facultad de Ciencias y la Escuela H. Thomas Gosnell de Ciencias de la Vida en el Instituto de Tecnología de Rochester busca de apoyo. Este trabajo fue apoyado en parte por la Fundación Nacional de Ciencia de Estados Unidos (NSF) premio a AOH MCB-1120541.
Materials
| E. coli mutants | Hudson/Savka lab or CGSC (http://cgsc.biology.yale.edu/) | |
| Electroporator | Biorad-USA | 1652100 |
| Electroporation Cuvettes | Biorad-USA | 1652082 |
| Temperature controlled incubator | Generic | |
| Microcentrifuge | Generic | |
| Luria Agar | Thermofisher Scientific | 22700025 |
| Luria Broth | Thermofisher Scientific | 12795084 |
| M9 Medium | Sigma-Aldrich | 63011 |
| Potato Dextrose Medium | Fisher Scientfic | DF0013-15-8 |
| Kanamycin | Sigma-Aldrich | K1377 |
| Diaminopimelate | Sigma-Aldrich | 92591 |
| Thymine | Sigma-Aldrich | T0376 |
| Chloramphenicol | Sigma-Aldrich | C0378 |
| Tyrosine | Sigma-Aldrich | T3754 |
| Phenlylalanine | Sigma-Aldrich | P2126 |
| Aspartate | Sigma-Aldrich | A9256 |
| Valine | Sigma-Aldrich | V0500 |
| Leucine | Sigma-Aldrich | L8000 |
| Isoleucine | Sigma-Aldrich | I2752 |
| Uracil | Sigma-Aldrich | U0750 |
| Gylcerol | Sigma-Aldrich | G5516 |
| Arabinose | Sigma-Aldrich | A3256 |
| Tetracyline | Sigma-Aldrich | 87128 |
| Taq DNA polymerase | Thermofisher Scientific | 10342-020 |
| Platinum pfx DNA polymerase | Thermofisher Scientific | 11708-013 |
| T4 DNA ligase | Thermofisher Scientific | 15224-041 |
| E coli Dh5-alpha | Thermofisher Scientific | 18258012 |
| E coli Top10 | Thermofisher Scientific | C4040-03 |
| pET100D/topo vector | Thermofisher Scientific | K100-01 |
| pCR2.1 Vector | Thermofisher Scientific | K2030-01 |
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