قياس مستويات مرناً على مر الزمن من خلال "الاستجابة" الخميرة التاكسج S. cerevisiae
Summary
نقدم هنا، بروتوكول باستخدام تسلسل الحمض النووي الريبي لرصد مستويات مرناً على مر الزمن من خلال استجابة الخلايا S. cerevisiae التاكسج. هذا الأسلوب يمكن تكييفها لتحليل التعبير الجيني أثناء أي الاستجابة الخلوية.
Abstract
التغييرات المعقدة في التعبير الجيني التوسط عادة جزءا كبيرا من الاستجابة الخلوية. قد تتغير كل الجينات التعبير مع حركية فريدة الجينات يخضع لتوقيت معين واحد من العديد من المحفزات، مما يشير إلى الممرات أو الآثار الثانوية. من أجل التقاط الجين كامل استخدمت التعبير استجابة لنقص في الخميرة S. cerevisiae، تحليل الحمض النووي الريبي seq لرصد مستويات مرناً لجميع الجينات في أوقات معينة بعد التعرض لنقص. أنشأت نقص نمو الخلايا في الغاز2 ~ 100% N. الأهم من ذلك، خلافا لغيرها من الدراسات التاكسج، ارجوستيرول، والأحماض الدهنية غير المشبعة لا أضيفت إلى وسائل الإعلام لأن تؤثر هذه المستقلبات في التعبير الجيني. وقد اختيرت النقاط الزمنية في نطاق 0-4 ح بعد نقص نظراً لأن تلك الفترة يلتقط التغييرات الرئيسية في التعبير الجيني. في كل مرة نقطة، سجل منتصف التاكسج الزنزانات بسرعة تصفيتها، وتجميد، والحد من التعرض للتغيرات س2 وملازم في التعبير الجيني. مجموع الحمض النووي الريبي المستخرج من الخلايا واستخدامه لإثراء مرناً، ثم حولتها إلى كدنا. من هذا كدنا، تم إنشاء مكتبات متعددة وكانت متسلسلة عينات ثمانية أو أكثر في حارة واحدة من المنظم الجيل القادم. يرد وصف خط أنابيب بعد انتهاء تسلسل، التي تشمل نوعية قاعدة التشذيب، قراءة الخرائط وتحديد عدد القراءات كل الجينات. واستخدمت DESeq2 داخل بيئة التطوير الإحصائي لتحديد الجينات التي تتغير بشكل كبير في أي من النقاط الزمنية التاكسج. وكشف تحليل لثلاثة replicates البيولوجي إمكانية تكرار نتائج عالية، وجينات حركية مختلفة وعدد كبير من المتوقع س2-تنظيم الجينات. هذه الأساليب يمكن استخدامها لدراسة كيفية استجابة خلايا الكائنات الحية المختلفة لنقص على مر الزمن وتكييفها لدراسة التعبير الجيني أثناء الاستجابات الخلوية الأخرى.
Introduction
العديد من الكائنات الحية يستجيب لنقص أو انخفاض س2، بتغيير الجينات التعبير 1،،من23. هذا الرد يساعد على التعامل مع عدم وجود ركيزة حاسمة للتنفس الهوائي وردود الفعل السكروز عدة، ولكن أيضا مع حالة الأكسدة متغيرة 4خلايا. تظهر عدة دراسات ميكرواري أداؤها في S. cerevisiae أن مستويات مرناً لمئات جينات تتغير استجابة لنقص 5،،من67،،من89 , 10 , 11 , 12-في الآونة الأخيرة، تم استخدام تسلسل الحمض النووي الريبي لوصف التغييرات التعبير الجيني مع مرور الوقت من خلال نقص 13. هنا، يتم عرض تفاصيل التجريبية ومناقشتها.
نقص يمكن أن يتحقق بطرق مختلفة، كل منها مستوى مختلف من س2إنتاج. هنا، أنشأت تتدفق باستمرار نقص فائقة عالية النقاء ن2 في قوارير، مما يقلل من [س2] حله فورا مع حركية استنساخه 10. فمن الممكن أن هناك بعض س2 جزيئات الحالية التي تساهم في التعبير الأيض والجينات ولكن هذه البيئة يعتبر جداً قريبة من اللاهوائية. نظراً لغياب س2، لا خلايا الخميرة الهيم biosynthesize، ارجوستيرول، والأحماض الدهنية غير المشبعة 4،،من1214. وهكذا، شملت الدراسات السابقة هذه المستقلبات عندما تنمو الخميرة دون أكسجين 5،،من1015. بيد الكثير من الردود التاكسج هي توسط استنفاد هذه المستقلبات وتجديد لهم ومن ثم عكس التعبير الجيني التاكسج الردود 12،16. أجل تقليد نقص الطبيعية، لم يتم إضافة هذه المستقلبات لوسائل الإعلام. في وقت قصير أن الخلايا قد تعرضت لنقص دون وجود نواتج الأيض الأساسية هذه، كان هناك لا زيادة ملحوظة في موت الخلية (البيانات لا تظهر) ولا استجابة إجهاد طويلة 13.
الاستجابة أيضا يعتمد على السلالة وعن النمط الوراثي. أهمية خاصة الآليلات المنظمين المعروفة من الردود التاكسج 2. الخلفية سلالة S288C المطلوب هو درجة عالية حيث أن نتائج يمكن مقارنتها بغيرها من الدراسات الجينومية تنفيذها مع هذه السلالة. ومع ذلك، يتضمن S288C اليل فقدان لوظيفة جزئية من HAP1 الجينات 17، منظم النسخي حرجة للاستجابة التاكسج. تم إصلاح هذا اليل في S288C wildtype باستخدام نسخة من Σ1278b سلالة الخلفية 11.
التعبير الجيني تعتمد اعتماداً كبيرا على البيئة الخلوية. وهكذا، عند إجراء تحليل مرناً على نطاق الجينوم، المهم الحفاظ على بيئة ثابتة بينما متفاوتة معلمة أخرى مثل الوقت أو الحافز أو الوراثي. لتحقيق نتائج عالية استنساخه، النظر في هذه الممارسات الثلاث للدراسة وجميعها لها replicates البيولوجية أو التقنية. أولاً، experimenter(s) نفسه ينبغي الاضطلاع بهذه الدراسة، حيث قد تختلف الممارسات التقنية عبر المجربون. ثانيا، ينبغي استخدام نفس الدفعة من المكونات في وسائط النمو ككل دفعة بتشكيل مختلف قليلاً يمكن أن يؤثر على التعبير الجيني. ثالثا، للتقليل من آثار دورة الخلية، كل نقطة مرة ينبغي أن يتألف من خلايا غير متزامن في سجل منتصف مرحلة النمو (1-2 × 107 خلايا/مل).
عندما وصف استجابة معقدة مثل الاستجابة التعبير الجيني لنقص، دورة وقت مفيد لتحديد حركية الأحداث المختلفة. وينبغي اختيار النقاط الزمنية المحددة التي سيتم التقاط التغييرات الرئيسية للاستجابة. في هذه الدراسة، لوحظت النقاط الزمنية بين 0 وح 4، لأن التجارب الماضية كشفت عن تغييرات واسعة النطاق في التعبير الجيني خلال هذه الفترة 13.
وكان تسلسل الحمض النووي الريبي لقياس التعبير الجيني العالمي، المستخدمة 18،19. يستخدم هذا الأسلوب تسلسل الجيل القادم لتحديد الوفرة النسبية للنسخة الجينات كل. مقارنة لتحليل الحمض النووي ميكرواري، يسلك تسلسل الحمض النووي الريبي حساسية أعلى (للكشف عن النصوص أقل وفرة)، أكبر مجموعة ديناميكية (لقياس أكبر إضعاف التغييرات) وإمكانية تكرار نتائج متفوقة (أن تتبع بدقة التعبير الجيني على مر الزمن). عادة ما يكون هو الحمض النووي الريبي الخلوية الأكثر الرنا الريباسي قد وضعت أساليب كثيرة لإثراء للحمض النووي الريبي محددة الأنواع 20. هنا، واستخدمت خرز بولي-T لتنقية بولي-A التي تحتوي على نصوص مرناً، على الرغم من مختلف تجارياً-مجموعات استنفاد الرنا الريباسي متاح يمكن أيضا أن تكون فعالة في إثراء مرناً.
هنا، اتسم رد التعبير الجيني S. cerevisiae لنقص. كانت تتعرض لنقص الخلايا وثم أخذ عينات في ثماني نقاط زمنية (0، 5، 10، 30، 60، 120، 180 و 240 دقيقة). للتأكد من إمكانية تكرار نتائج وتحديد النصوص المتغيرة إحصائيا، أجريت ثلاث replicates البيولوجية. الجيش الملكي النيبالي المستخرجة بواسطة تعطيل الميكانيكية وتنقية العمود، وثم تجهيزها لتحليل الحمض النووي الريبي seq. يتم وصف خط الأنابيب بعد انتهاء التسلسل وترد البرمجة النصية التي تسمح لإجراء النسخ المتماثل المحدد من التحليلات. تريموماتيك 21TopHat2 22، هتسيق 23، البيئة الإحصائية ص 24و حزمة DESeq2 25 وعلى وجه التحديد، استخدمت لمعالجة البيانات تسلسل الحمض النووي الريبي وتحديد الجينات 607 التي تغير بشكل ملحوظ خلال نقص. تحليل العنصر الرئيسي (PCA) والتعبير الجيني replicates أشارت إلى إمكانية تكرار نتائج هذا الأسلوب. كشف المجموعات و heatmaps حركية التعبير واسعة النطاق، بينما أظهر التحليل الجيني علم الوجود (GO) أن العديد من العمليات الخلوية، مثل التنفس الهوائي، وهي أثرت في مجموعة الجينات التي تنظم الأكسجين.
Protocol
Representative Results
Discussion
في هذه الدراسة، وتم قياس مستويات مرناً لجميع الجينات أثناء نقص في الخميرة S. cerevisiae. وكان الهدف تحليل التغيرات التعبير الجيني العالمي نتيجة للنمو في بيئة تسيطر عليها قرب وصول. اتخذت عدة خطوات لضمان أن الطريقة الموصوفة هنا التي تسيطر عليها بعناية واستنساخه. أولاً، تعرض الخلايا لبيئة ال?…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
ونشكر المعهد لويس Sigler “تسلسل الجينوم التكاملية الأساسية مرفق” في جامعة برينستون للمشورة التقنية وإعداد مكتبة الجيش الملكي النيبالي وتسلسلها. كان يؤيد هذا العمل من المنح المقدمة من جامعة روان، والمعاهد الوطنية للصحة نيجمس R15GM113187 إلى M.J.H.
Materials
| Enclosed dry incubator | Thermo Scientific | MaxQ 4000 | Set at 30°C. Modify the door to allow entry of one Tygon tube. Alternatively, use the New Brunswick G25 incubator, which contains a tube port. Do not use an open-air water shaker, as condensation will collect in the tubes between flasks, possibly cross-contaminating cultures. |
| Micro-analysis Filter Holder | Millipore | XX1002530 | 25mm diameter, stainless steel support, no. 5 perforated silicone stopper mounts in standard 125mL filtering flask |
| Strong vacuum | Edwards | E-LAB 2 | The “house” vacuum may be too weak. Alternatively, use an electric-power portable vacuum pump like the one listed here. |
| 1000-mL flask | To act as vacuum trap. | ||
| ~2-foot lengths of Heavy Wall Vacuum Tubing, inner diameter 3/8 in, outer diameter 7/8 in | Tygon | 38TT | Two pieces: the first connects vacuum to trap, and the second connects trap to filter system. |
| High-pressure N2 gas tank | 99.999% purity, >1000psi, with a regulator and gas flow controller | ||
| Autoclaved 500mL flask | Opening covered with aluminum foil. One for each yeast strain. | ||
| Autoclaved 250mL flasks | Openings covered with aluminum foil. One for each time point plus two for water traps. | ||
| Flask stoppers (size 6, two holes with 5mm diameter) | Sterilized with 70% ethanol. One for each flask. | ||
| Glass tubing, length 9 cm or 17 cm, inner diameter 2 mm, outer diameter 5 mm | Sterilized with 70% ethanol. Two tubes for each flask. Place into the holes of each stopper. See Figure 1 for placement of 9- vs 17- cm tubes. | ||
| ~25-cm lengths of plastic tubing, inner diameter 5 mm | Tygon | E-3603 | One piece for each flask. Sterilized with 70% ethanol. |
| Sterile filter discs | Millipore | HAWP02500 | 25mm diameter, 0.45 µm pore size, one for each time point |
| Sterile dH2O (~100mL) | |||
| 1-mL cuvettes | For measuring OD600 (i.e., cell concentration) | ||
| 50-mL sterile centrifuge tubes | One for each time point | ||
| Clean and sterile tweezers | |||
| liquid nitrogen | For freezing cells | ||
| acid-washed beads | Sigma | G8772 | Keep at 4°C for lysing cells |
| Qiagen RNeasy Mini Kit | Qiagen | 74104 | For RNA column purification |
| Qiagen RLT buffer | Prepare by adding 10µL of β-Mercaptoethanol per 1mL of RLT buffer, keep at 4C. | ||
| 2-mL collection tubes | Qiagen | included in the Qiagen Rneasy Mini Kit | |
| Buffer RPE | Qiagen | included in the Qiagen Rneasy Mini Kit | |
| Buffer RW1 | Qiagen | included in the Qiagen Rneasy Mini Kit | |
| DNase I stock and working solutions | Qiagen | 79254 | The DNase I enzyme comes as lyophilized powder in a glass vial. Using a sterile needle and syringe, inject 550µL of RNase-free water (provided in Qiagen kit) into the vial. Mix by gently inverting the bottle. To avoid denaturing the enzyme, do not vortex. Using a pipet, remove this stock solution from the vial and store in freezer (-20°C) in single-use aliquots (80µL each). The stock solution should not be thawed and refrozen. |
| Buffer RDD | Qiagen | included in the Qiagen DNase Kit | |
| Ice cold 2-mL screw-cap tubes | For lysing cells during RNA extraction | ||
| bead mill homogenizer | Biospec Mini-Beadbeater-24 | 112011 | Keep in cold room |
| Bacto Peptone | BD | DF0118 | for liquid YPD media |
| Bacto Yeast Extract | BD | DF0886 | for liquid YPD media |
| glucose | Fisher | D16 | for liquid YPD media |
| Qubit assay tubes | Thermo Fisher | Q32856 | for measuring nucleic acid concentration |
| Quant-iTTM dsDNA BR Assay Kit | Thermo Fisher | Q32853 | for measuring nucleic acid concentration |
| Quant-iTTM RNA Assay Kit | Thermo Fisher | Q32855 | for measuring nucleic acid concentration |
| Qubit Fluorometer | Thermo Fisher | Q33216 | for measuring nucleic acid concentration |
| Commercial electrophoresis system | Agilent | Bioanalyzer 2100 | for measuring nucleic acid quality |
| Next-generation sequencer | Illumina | HiSeq 2500 | for sequencing libraries |
| automated liquid handling system | Wafergen | Apollo 324 | for creating sequencing libraries |
| PrepX PolyA mRNA Isolation Kit | Wafergen | 400047 | for isolating mRNA from total RNA |
| PrepX RNA SEQ for Illumina Library Kit | Wafergen | 400039 | for creating strand-specific sequencing libraries from total RNA |
| Barcode Splitter | https://toolshed.g2.bx.psu.edu/repository?repository_id=7119c4f7a89efa57&changeset_revision=e7b7cdc1834d | ||
| Samtools, which includes the gzip command | http://www.htslib.org/download/ | ||
| Trimmomatic | http://www.usadellab.org/cms/?page=trimmomatic | ||
| Bowtie2 (installed before TopHat) | http://bowtie-bio.sourceforge.net/bowtie2/index.shtml | ||
| TopHat | https://ccb.jhu.edu/software/tophat/index.shtml | ||
| HTSeq | http://www-huber.embl.de/HTSeq/doc/overview.html | ||
| R (installed before R Studio) | https://cran.rstudio.com | ||
| R Studio (free version) | https://www.rstudio.com/products/rstudio/download/ |
Referenzen
- Semenza, G. L. Oxygen sensing, homeostasis, and disease. New Eng. J Med. 365 (6), 537-547 (2011).
- Butler, G. Hypoxia and gene expression in eukaryotic microbes. Annu. Rev. Micro. 67, 291-312 (2013).
- Ratcliffe, P. J. Oxygen sensing and hypoxia signalling pathways in animals: the implications of physiology for cancer. J. Physiol. 591 (Pt 8), 2027-2042 (2013).
- Rosenfeld, E., Beauvoit, B. Role of the non-respiratory pathways in the utilization of molecular oxygen bySaccharomyces cerevisiae. Yeast. 20 (13), 1115-1144 (2003).
- Ter Linde, J. J., et al. Genome-wide transcriptional analysis of aerobic and anaerobic chemostat cultures of Saccharomyces cerevisiae. J. Bacteriol. 181 (24), 7409-7413 (1999).
- Ter Linde, J. J., Steensma, H. Y. A microarray-assisted screen for potential Hap1 and Rox1 target genes in Saccharomyces cerevisiae. Yeast. 19 (10), 825-840 (2002).
- Kwast, K. E., et al. Genomic analyses of anaerobically induced genes in Saccharomyces cerevisiae: functional roles of Rox1 and other factors in mediating the anoxic response. J. Bacteriol. 184 (1), 250-265 (2002).
- Becerra, M., et al. The yeast transcriptome in aerobic and hypoxic conditions: effects of hap1, rox1, rox3 and srb10 deletions. Mol. Microbiol. 43 (3), 545-555 (2002).
- Lai, L. -. C., Kosorukoff, A. L., Burke, P. V., Kwast, K. E. Dynamical remodeling of the transcriptome during short-term anaerobiosis in Saccharomyces cerevisiae: differential response and role of Msn2 and/or Msn4 and other factors in galactose and glucose media. Mol. Cell. Biol. 25 (10), 4075-4091 (2005).
- Lai, L. C., Kosorukoff, A. L., Burke, P. V., Kwast, K. E. Metabolic-State-Dependent Remodeling of the Transcriptome in Response to Anoxia and Subsequent Reoxygenation in Saccharomyces cerevisiae. Euk. Cell. 5 (9), 1468-1489 (2006).
- Hickman, M. J., Winston, F. Heme levels switch the function of Hap1 of Saccharomyces cerevisiae between transcriptional activator and transcriptional repressor. Mol. Cell. Biol. 27 (21), 7414-7424 (2007).
- Hickman, M. J., Spatt, D., Winston, F. The Hog1 mitogen-activated protein kinase mediates a hypoxic response in Saccharomyces cerevisiae. Genetik. 188 (2), 325-338 (2011).
- Bendjilali, N., et al. Time-Course Analysis of Gene Expression During the Saccharomyces cerevisiae Hypoxic Response. G3. 7 (1), 221-231 (2017).
- Chellappa, R., et al. The membrane proteins, Spt23p and Mga2p, play distinct roles in the activation of Saccharomyces cerevisiae OLE1 gene expression. Fatty acid-mediated regulation of Mga2p activity is independent of its proteolytic processing into a soluble transcription activator. J. Biol. Chem. 276 (47), 43548-43556 (2001).
- Abramova, N. E., et al. Regulatory mechanisms controlling expression of the DAN/TIR mannoprotein genes during anaerobic remodeling of the cell wall in Saccharomyces cerevisiae. Genetik. 157 (3), 1169-1177 (2001).
- Hughes, A. L., Todd, B. L., Espenshade, P. J. SREBP Pathway Responds to Sterols and Functions as an Oxygen Sensor in Fission Yeast. Cell. 120 (6), 831-842 (2005).
- Gaisne, M., Bécam, A. M., Verdière, J., Herbert, C. J. A "natural" mutation in Saccharomyces cerevisiae strains derived from S288c affects the complex regulatory gene HAP1 (CYP1). Curr. Gen. 36 (4), 195-200 (1999).
- Wang, Z., Gerstein, M., Snyder, M. RNA-Seq: a revolutionary tool for transcriptomics. Nat. Rev. Gen. 10 (1), 57-63 (2009).
- Anders, S., Huber, W. Differential expression analysis for sequence count data. Genome Biol. 11 (10), R106 (2010).
- Conesa, A., et al. A survey of best practices for RNA-seq data analysis. Genome Biol. 17 (1), 13 (2016).
- Bolger, A. M., Lohse, M., Usadel, B. Trimmomatic: a flexible trimmer for Illumina sequence data. Bioinf. 30 (15), 2114-2120 (2014).
- Kim, D., Pertea, G., Trapnell, C., Pimentel, H., Kelley, R., Salzberg, S. L. TopHat2: accurate alignment of transcriptomes in the presence of insertions, deletions and gene fusions. Genome Biol. 14 (4), R36 (2013).
- Anders, S., Pyl, P. T., Huber, W. HTSeq–A Python framework to work with high-throughput sequencing data. Bioinf. 31 (2), 166-169 (2015).
- . R: A Language and Environment for Statistical Computing Available from: https://www.R-project.org (2015)
- Love, M. I., Huber, W., Anders, S. Moderated estimation of fold change and dispersion for RNA-seq data with DESeq2. Genome Biol. 15 (12), 550 (2014).
- Brown, T., Mackey, K., Du, T. Analysis of RNA by Northern and Slot Blot Hybridization. Curr. Prot. Mol. Biol. 74, 4.9.1-4.9.19 (2004).
- Edgar, R., Domrachev, M., Lash, A. E. Gene Expression Omnibus: NCBI gene expression and hybridization array data repository. Nuc. Acids Res. 30 (1), 207-210 (2002).
- Cherry, J. M., et al. Saccharomyces Genome Database: the genomics resource of budding yeast. Nuc. Acids Res. 40, D700-D705 (2012).
- Hothorn, T., Everitt, B. S. . A Handbook of Statistical Analyses using R. , (2014).
- Saldanha, A. J. Java Treeview–extensible visualization of microarray data. Bioinformatics. 20 (17), 3246-3248 (2004).
- Eisen, M. B., Spellman, P. T., Brown, P. O., Botstein, D. Cluster analysis and display of genome-wide expression patterns. Proc. Nat. Acad. Sci. 95 (25), 14863-14868 (1998).
- Davies, B. S. J., Rine, J. A Role for Sterol Levels in Oxygen Sensing in Saccharomyces cerevisiae. Genetik. 174 (1), 191-201 (2006).
- Meena, R. C., Kumar, N., Nath, S., Chakrabarti, A. Homologous Recombination is Activated at Early Time Points Following Exposure to Cobalt Chloride Induced Hypoxic Conditions in Saccharomyces cerevisiae. Ind. J. Microb. 52 (2), 209-214 (2012).
- Snoek, I. S. I., Tai, S. L., Pronk, J. T., Yde Steensma, H., Daran, J. -. M. Involvement of Snf7p and Rim101p in the transcriptional regulation of TIR1 and other anaerobically upregulated genes in Saccharomyces cerevisiae. FEMS Yeast Res. 10 (4), 367-384 (2010).
- Ellahi, A., Thurtle, D. M., Rine, J. The Chromatin and Transcriptional Landscape of Native Saccharomyces cerevisiae Telomeres and Subtelomeric Domains. Genetik. 200 (2), 505-521 (2015).
- Collart, M. A., Oliviero, S., et al. Preparation of yeast RNA. Curr. Prot. Mol. Biol. , (2001).
- Blankenberg, D., et al. Manipulation of FASTQ data with Galaxy. Bioinf. 24 (14), 1783-1785 (2010).
- Martini, P., et al. timeClip: pathway analysis for time course data without replicates. BMC Bioinf. 15, (2014).
- Oh, S., Song, S., Grabowski, G., Zhao, H., Noonan, J. P. Time series expression analyses using RNA-seq: a statistical approach. BioMed Res. Int. 2013, 1-16 (2013).
