מדידת רמות ה-mRNA לאורך זמן במהלך שמרים ס' cerevisiae ובשפתיים התגובה
Summary
כאן, אנו מציגים פרוטוקול בעזרת RNA-seq לנטר את רמות ה-mRNA לאורך זמן במהלך התגובה שתקבעו של cerevisiae ס תאים. בשיטה זו ניתן להתאים לנתח ביטוי גנים במהלך כל תגובה תאית.
Abstract
מתחם שינויים בביטוי הגנים מתווכים בדרך כלל חלק גדול של תגובה תאית. כל הגן עשויים להשתנות הביטוי קינטיקה ייחודי כמו הגן מוסדר על ידי עיתוי מסוים אחד של גירויים רבים, איתות המסלולים או השפעות משניות. כדי לתפוס את הגן כולו ביטוי בתגובה היפוקסיה ב שמרים cerevisiae ס, ניתוח ה-RNA-seq שימש כדי לנטר את רמות ה-mRNA של כל הגנים במועדים ספציפיים לאחר חשיפה היפוקסיה. היפוקסיה הוקמה על ידי גידול תאי גז2 ~ 100% N. חשוב, בניגוד מחקרים אחרים שתקבעו, ergosterol, חומצות שומן בלתי רוויות לא נוספו לכלי התקשורת כי מטבוליטים אלה משפיעים על ביטוי גנים. נקודות זמן נבחרו בטווח של 0 – 4 שעות לאחר היפוקסיה כי תקופה זו לוכדת את השינויים העיקריים בביטוי הגנים. בכל נקודה בזמן, היו תאים ובשפתיים יומן אמצע במהירות מסונן, קפוא, הגבלת החשיפה O2 ו הנלווה שינויים בביטוי הגנים. RNA הכולל היה שחולצו מן התאים, משמש כדי להעשיר את ה-mRNA, אשר לאחר מכן הוסב cDNA. CDNA זו, נוצרו ספריות מולטיפלקס, דגימות 8 או יותר היו וסודרו בנתיב אחד של ברצף הדור הבא. צינור שלאחר רצף מתואר, אשר כוללת חיתוך בסיס איכות, לקרוא מיפוי וקביעת מספר קריאות לכל הגנים. DESeq2 סביבת סטטיסטי של R שימשה לזיהוי גנים לשנות באופן משמעותי בכל אחד של נקודות זמן שתקבעו. ניתוח של משכפל ביולוגי שלושה גילה הפארמצבטית גבוהה, הגנים של קינטיקה שונות ומספר רב של ציפה O2-מוסדר גנים. שיטות אלה שניתן להשתמש כדי ללמוד כיצד התאים של אורגניזמים שונים מגיבים היפוקסיה לאורך זמן ו הותאם ללמוד ביטוי גנים במהלך תגובות אחרים התאית.
Introduction
אורגניזמים רבים מגיבים היפוקסיה או O נמוך2, על ידי שינוי גנטי ביטוי 1,2,3. תגובה זו מסייעת להתמודד עם חוסר קריטי עבור נשימה אירובית, כמה תגובות biosynthetic הוחלף נגזר מצע, אלא גם עם מצב חמצון-חיזור המשתנים 4תאים. מספר מחקרים microarray הופיעה cerevisiae ס מראים כי רמות ה-mRNA של מאות גנים שינוי בתגובה היפוקסיה 5,6,–7,–8,–9 , 10 , 11 , 12. לאחרונה, ה-RNA-seq שימש לאפיין שינויים בביטוי הגנים לאורך זמן במהלך היפוקסיה 13. כאן מוצגים הפרטים ניסיוני ודן.
היפוקסיה יכול להיעשות בדרכים שונות, כל אחת לייצר רמה שונה של O2. . הנה, היפוקסיה הוקמה על ידי זורם באופן רציף אולטרא-גבוה-טוהר N2 לתוך מבחנות, אשר מוריד את [O2] התפרקה באופן מיידי עם קינטיקה לשחזור 10. זה אפשרי כי ישנם כמה O2 מולקולות נוכח שתורמים ביטוי חילוף החומרים, ג’ין אבל סביבה זו נחשבת מאוד קרוב אנאירובית. בהיעדר O2, תאי שמרים לא biosynthesize heme, ergosterol, חומצות שומן בלתי רוויות 4,12,14. לכן, מחקרים קודמים כללו מטבוליטים אלה כאשר גדל שמרים ללא חמצן 5,10,15. עם זאת, תגובות ובשפתיים רבים הם מתווכת על ידי דלדול של מטבוליטים אלה, ובכך חידוש אותם מפלות 12,16תגובות ביטוי גנים ובשפתיים. כדי לחקות היפוקסיה טבעי, מטבוליטים אלה לא נוספו לכלי התקשורת. בזמן הקצר כי תאים נחשפו היפוקסיה ללא הנוכחות של מטבוליטים חיוניים אלה, היה ללא עלייה ניכרת מוות תאי (נתונים לא מוצג) ולא של מתח ממושך בתגובה 13.
התגובה היא גם תלויה במתח, גנוטיפ שלה. חשוב במיוחד הם אללים של הרגולטורים הידוע של תגובות ובשפתיים 2. רקע המתח S288C רצוי מאוד כך ניתן להשוות תוצאות המחקרים גנומית אחרים עם זן זה. עם זאת, S288C מכיל של אלל אובדן-של-פונקציה חלקית מתוך HAP1 ג’ין 17, הרגולטור תעתיק קריטיים על התגובה ובשפתיים. אלל הזה תוקן ב- S288C באמצעות wildtype העתק מן Σ1278b זן רקע 11.
ביטוי גנים הוא תלוי מאוד הסביבה התאית. לפיכך, בעת ביצוע ניתוח mRNA הגנום כולו, חשוב לשמור על סביבה מתמדת תוך שינוי פרמטר נוסף כגון זמן, גירוי או גנוטיפ. כדי להשיג תוצאות מאוד לשחזור, שקול שיטות עבודה מומלצות שלושה אלה לצורך המחקר ואת כל שלה ביולוגי או טכנית משכפל. קודם כל, experimenter(s) אותו צריך לבצע את המחקר, מאז שיטות טכניות עשויים להשתנות על פני ניסויים. שנית, מאותה אצווה של מרכיבים אמור לשמש בתקשורת צמיחה כמו כל אצווה יש קומפוזיציה שונה במקצת, אשר יכולים להשפיע על ביטוי גנים. שלישית, כדי למזער את ההשפעות מחזור התא, כל נקודת זמן צריכה להכיל תאים אסינכרוני בשלב אמצע יומן של צמיחה (1-2 x 107 תאים/mL).
כאשר אפיון תגובה מורכבים כמו התגובה ביטוי גנים היפוקסיה, קורס זמן הוא יתרון בקביעת את קינטיקה של אירועים שונים. נקודות זמן מסוים צריך להיבחר כי ללכוד את השינויים העיקריים של התגובה. במחקר זה, נצפו נקודות זמן בין 0 ל- 4 שעות, כי ניסויים קודמים חשפו נרחבת שינויים בביטוי הגנים במהלך תקופה זו, 13.
כדי למדוד ביטוי גנים גלובלית, RNA-seq היה בשימוש 18,19. שיטה זו משתמשת הדור הבא רצפי כדי לקבוע שפע יחסי התעתיק של ג’ין כל. לעומת ניתוח microarray DNA, RNA-seq תערוכות רגישות גבוהה יותר (כדי לזהות תעתיקים פחות בשפע), טווח דינמי גדול (למדוד שינויים קיפול גדול), הפארמצבטית סופריור (לעקוב במדויק ביטוי גנים לאורך זמן). בדרך כלל, רנ א ביותר הסלולר היא ribosomal RNA שפותחו שיטות רבות להעשרת RNA ספציפיים מינים 20. . פולי-T חרוזים שימשו לטיהור poly-A-המכיל mRNA תעתיקים, למרות השונות מסחרית – ערכות דלדול rRNA זמינים גם יכול להיות יעיל ב- mRNA העשרה.
כאן, התאפיינה התגובה ביטוי cerevisiae ס גנים היפוקסיה. התאים היו חשופים היפוקסיה, ואז לטעום-8 נקודות זמן (0, 5, 10, 30, 60, 120, 180, 240 דקות). כדי לאשר הפארמצבטית וכדי לזהות תעתיקים סטטיסטית שהשתנו, משכפל ביולוגי שלוש בוצעו. RNA היה שחולצו על ידי הפרעה מכנית וטיהור עמודה ולאחר מכן מעובד לניתוח RNA-seq. הצינור שלאחר רצף מתואר, תכנות סקריפטים ניתנים לאפשר שכפול מדויק של הניתוחים שבוצעו. באופן ספציפי, Trimmomatic 21, TopHat2 22, HTseq 23, את הסביבה סטטיסטי R 24, ו DESeq2 חבילה 25 שימשו כדי לעבד את הנתונים RNA-seq לזיהוי גנים ועוד 607 חסימות לשנות באופן משמעותי במהלך היפוקסיה. ניתוח גורמים ראשיים (PCA), ביטוי גנים של משכפל ציינו את הפארמצבטית של הטכניקה. שירות האשכולות, heatmaps גילה ביטוי נרחב קינטיקה, בעוד מפענוח אונטולוגיה (קדימה) הראה כי תהליכים תאיים רבים, כמו נשימה אירובית, מועשרים בערכה של גנים מוסדר חמצן.
Protocol
Representative Results
Discussion
במחקר זה, רמות ה-mRNA של כל הגנים נמדדה במהלך היפוקסיה ב ס cerevisiaeהשמרים. המטרה הייתה לבחון שינויים בביטוי גנים איך כלליים עקב גדילה בסביבה מבוקרת ליד-אנאוקסיים. מספר פעולות נעשו כדי להבטיח כי השיטה המתוארת כאן היה מבוקר ובזהירות לשחזור. ראשית, תאים נחשפו לסביבה ובשפתיים מוגדרים במדויק: 99….
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
אנו מודים מכון לואיס-סיגלר על מתקן הליבה רצף גנומיקה אינטגרטיבית ב אוניברסיטת פרינסטון עצות טכניות ועל הכנה ספריית ה-RNA ורצף. עבודה זו נתמכה על ידי מענקים מאוניברסיטת רוואן ו NIH NIGMS R15GM113187 M.J.H.
Materials
| Enclosed dry incubator | Thermo Scientific | MaxQ 4000 | Set at 30°C. Modify the door to allow entry of one Tygon tube. Alternatively, use the New Brunswick G25 incubator, which contains a tube port. Do not use an open-air water shaker, as condensation will collect in the tubes between flasks, possibly cross-contaminating cultures. |
| Micro-analysis Filter Holder | Millipore | XX1002530 | 25mm diameter, stainless steel support, no. 5 perforated silicone stopper mounts in standard 125mL filtering flask |
| Strong vacuum | Edwards | E-LAB 2 | The “house” vacuum may be too weak. Alternatively, use an electric-power portable vacuum pump like the one listed here. |
| 1000-mL flask | To act as vacuum trap. | ||
| ~2-foot lengths of Heavy Wall Vacuum Tubing, inner diameter 3/8 in, outer diameter 7/8 in | Tygon | 38TT | Two pieces: the first connects vacuum to trap, and the second connects trap to filter system. |
| High-pressure N2 gas tank | 99.999% purity, >1000psi, with a regulator and gas flow controller | ||
| Autoclaved 500mL flask | Opening covered with aluminum foil. One for each yeast strain. | ||
| Autoclaved 250mL flasks | Openings covered with aluminum foil. One for each time point plus two for water traps. | ||
| Flask stoppers (size 6, two holes with 5mm diameter) | Sterilized with 70% ethanol. One for each flask. | ||
| Glass tubing, length 9 cm or 17 cm, inner diameter 2 mm, outer diameter 5 mm | Sterilized with 70% ethanol. Two tubes for each flask. Place into the holes of each stopper. See Figure 1 for placement of 9- vs 17- cm tubes. | ||
| ~25-cm lengths of plastic tubing, inner diameter 5 mm | Tygon | E-3603 | One piece for each flask. Sterilized with 70% ethanol. |
| Sterile filter discs | Millipore | HAWP02500 | 25mm diameter, 0.45 µm pore size, one for each time point |
| Sterile dH2O (~100mL) | |||
| 1-mL cuvettes | For measuring OD600 (i.e., cell concentration) | ||
| 50-mL sterile centrifuge tubes | One for each time point | ||
| Clean and sterile tweezers | |||
| liquid nitrogen | For freezing cells | ||
| acid-washed beads | Sigma | G8772 | Keep at 4°C for lysing cells |
| Qiagen RNeasy Mini Kit | Qiagen | 74104 | For RNA column purification |
| Qiagen RLT buffer | Prepare by adding 10µL of β-Mercaptoethanol per 1mL of RLT buffer, keep at 4C. | ||
| 2-mL collection tubes | Qiagen | included in the Qiagen Rneasy Mini Kit | |
| Buffer RPE | Qiagen | included in the Qiagen Rneasy Mini Kit | |
| Buffer RW1 | Qiagen | included in the Qiagen Rneasy Mini Kit | |
| DNase I stock and working solutions | Qiagen | 79254 | The DNase I enzyme comes as lyophilized powder in a glass vial. Using a sterile needle and syringe, inject 550µL of RNase-free water (provided in Qiagen kit) into the vial. Mix by gently inverting the bottle. To avoid denaturing the enzyme, do not vortex. Using a pipet, remove this stock solution from the vial and store in freezer (-20°C) in single-use aliquots (80µL each). The stock solution should not be thawed and refrozen. |
| Buffer RDD | Qiagen | included in the Qiagen DNase Kit | |
| Ice cold 2-mL screw-cap tubes | For lysing cells during RNA extraction | ||
| bead mill homogenizer | Biospec Mini-Beadbeater-24 | 112011 | Keep in cold room |
| Bacto Peptone | BD | DF0118 | for liquid YPD media |
| Bacto Yeast Extract | BD | DF0886 | for liquid YPD media |
| glucose | Fisher | D16 | for liquid YPD media |
| Qubit assay tubes | Thermo Fisher | Q32856 | for measuring nucleic acid concentration |
| Quant-iTTM dsDNA BR Assay Kit | Thermo Fisher | Q32853 | for measuring nucleic acid concentration |
| Quant-iTTM RNA Assay Kit | Thermo Fisher | Q32855 | for measuring nucleic acid concentration |
| Qubit Fluorometer | Thermo Fisher | Q33216 | for measuring nucleic acid concentration |
| Commercial electrophoresis system | Agilent | Bioanalyzer 2100 | for measuring nucleic acid quality |
| Next-generation sequencer | Illumina | HiSeq 2500 | for sequencing libraries |
| automated liquid handling system | Wafergen | Apollo 324 | for creating sequencing libraries |
| PrepX PolyA mRNA Isolation Kit | Wafergen | 400047 | for isolating mRNA from total RNA |
| PrepX RNA SEQ for Illumina Library Kit | Wafergen | 400039 | for creating strand-specific sequencing libraries from total RNA |
| Barcode Splitter | https://toolshed.g2.bx.psu.edu/repository?repository_id=7119c4f7a89efa57&changeset_revision=e7b7cdc1834d | ||
| Samtools, which includes the gzip command | http://www.htslib.org/download/ | ||
| Trimmomatic | http://www.usadellab.org/cms/?page=trimmomatic | ||
| Bowtie2 (installed before TopHat) | http://bowtie-bio.sourceforge.net/bowtie2/index.shtml | ||
| TopHat | https://ccb.jhu.edu/software/tophat/index.shtml | ||
| HTSeq | http://www-huber.embl.de/HTSeq/doc/overview.html | ||
| R (installed before R Studio) | https://cran.rstudio.com | ||
| R Studio (free version) | https://www.rstudio.com/products/rstudio/download/ |
Referenzen
- Semenza, G. L. Oxygen sensing, homeostasis, and disease. New Eng. J Med. 365 (6), 537-547 (2011).
- Butler, G. Hypoxia and gene expression in eukaryotic microbes. Annu. Rev. Micro. 67, 291-312 (2013).
- Ratcliffe, P. J. Oxygen sensing and hypoxia signalling pathways in animals: the implications of physiology for cancer. J. Physiol. 591 (Pt 8), 2027-2042 (2013).
- Rosenfeld, E., Beauvoit, B. Role of the non-respiratory pathways in the utilization of molecular oxygen bySaccharomyces cerevisiae. Yeast. 20 (13), 1115-1144 (2003).
- Ter Linde, J. J., et al. Genome-wide transcriptional analysis of aerobic and anaerobic chemostat cultures of Saccharomyces cerevisiae. J. Bacteriol. 181 (24), 7409-7413 (1999).
- Ter Linde, J. J., Steensma, H. Y. A microarray-assisted screen for potential Hap1 and Rox1 target genes in Saccharomyces cerevisiae. Yeast. 19 (10), 825-840 (2002).
- Kwast, K. E., et al. Genomic analyses of anaerobically induced genes in Saccharomyces cerevisiae: functional roles of Rox1 and other factors in mediating the anoxic response. J. Bacteriol. 184 (1), 250-265 (2002).
- Becerra, M., et al. The yeast transcriptome in aerobic and hypoxic conditions: effects of hap1, rox1, rox3 and srb10 deletions. Mol. Microbiol. 43 (3), 545-555 (2002).
- Lai, L. -. C., Kosorukoff, A. L., Burke, P. V., Kwast, K. E. Dynamical remodeling of the transcriptome during short-term anaerobiosis in Saccharomyces cerevisiae: differential response and role of Msn2 and/or Msn4 and other factors in galactose and glucose media. Mol. Cell. Biol. 25 (10), 4075-4091 (2005).
- Lai, L. C., Kosorukoff, A. L., Burke, P. V., Kwast, K. E. Metabolic-State-Dependent Remodeling of the Transcriptome in Response to Anoxia and Subsequent Reoxygenation in Saccharomyces cerevisiae. Euk. Cell. 5 (9), 1468-1489 (2006).
- Hickman, M. J., Winston, F. Heme levels switch the function of Hap1 of Saccharomyces cerevisiae between transcriptional activator and transcriptional repressor. Mol. Cell. Biol. 27 (21), 7414-7424 (2007).
- Hickman, M. J., Spatt, D., Winston, F. The Hog1 mitogen-activated protein kinase mediates a hypoxic response in Saccharomyces cerevisiae. Genetik. 188 (2), 325-338 (2011).
- Bendjilali, N., et al. Time-Course Analysis of Gene Expression During the Saccharomyces cerevisiae Hypoxic Response. G3. 7 (1), 221-231 (2017).
- Chellappa, R., et al. The membrane proteins, Spt23p and Mga2p, play distinct roles in the activation of Saccharomyces cerevisiae OLE1 gene expression. Fatty acid-mediated regulation of Mga2p activity is independent of its proteolytic processing into a soluble transcription activator. J. Biol. Chem. 276 (47), 43548-43556 (2001).
- Abramova, N. E., et al. Regulatory mechanisms controlling expression of the DAN/TIR mannoprotein genes during anaerobic remodeling of the cell wall in Saccharomyces cerevisiae. Genetik. 157 (3), 1169-1177 (2001).
- Hughes, A. L., Todd, B. L., Espenshade, P. J. SREBP Pathway Responds to Sterols and Functions as an Oxygen Sensor in Fission Yeast. Cell. 120 (6), 831-842 (2005).
- Gaisne, M., Bécam, A. M., Verdière, J., Herbert, C. J. A "natural" mutation in Saccharomyces cerevisiae strains derived from S288c affects the complex regulatory gene HAP1 (CYP1). Curr. Gen. 36 (4), 195-200 (1999).
- Wang, Z., Gerstein, M., Snyder, M. RNA-Seq: a revolutionary tool for transcriptomics. Nat. Rev. Gen. 10 (1), 57-63 (2009).
- Anders, S., Huber, W. Differential expression analysis for sequence count data. Genome Biol. 11 (10), R106 (2010).
- Conesa, A., et al. A survey of best practices for RNA-seq data analysis. Genome Biol. 17 (1), 13 (2016).
- Bolger, A. M., Lohse, M., Usadel, B. Trimmomatic: a flexible trimmer for Illumina sequence data. Bioinf. 30 (15), 2114-2120 (2014).
- Kim, D., Pertea, G., Trapnell, C., Pimentel, H., Kelley, R., Salzberg, S. L. TopHat2: accurate alignment of transcriptomes in the presence of insertions, deletions and gene fusions. Genome Biol. 14 (4), R36 (2013).
- Anders, S., Pyl, P. T., Huber, W. HTSeq–A Python framework to work with high-throughput sequencing data. Bioinf. 31 (2), 166-169 (2015).
- . R: A Language and Environment for Statistical Computing Available from: https://www.R-project.org (2015)
- Love, M. I., Huber, W., Anders, S. Moderated estimation of fold change and dispersion for RNA-seq data with DESeq2. Genome Biol. 15 (12), 550 (2014).
- Brown, T., Mackey, K., Du, T. Analysis of RNA by Northern and Slot Blot Hybridization. Curr. Prot. Mol. Biol. 74, 4.9.1-4.9.19 (2004).
- Edgar, R., Domrachev, M., Lash, A. E. Gene Expression Omnibus: NCBI gene expression and hybridization array data repository. Nuc. Acids Res. 30 (1), 207-210 (2002).
- Cherry, J. M., et al. Saccharomyces Genome Database: the genomics resource of budding yeast. Nuc. Acids Res. 40, D700-D705 (2012).
- Hothorn, T., Everitt, B. S. . A Handbook of Statistical Analyses using R. , (2014).
- Saldanha, A. J. Java Treeview–extensible visualization of microarray data. Bioinformatics. 20 (17), 3246-3248 (2004).
- Eisen, M. B., Spellman, P. T., Brown, P. O., Botstein, D. Cluster analysis and display of genome-wide expression patterns. Proc. Nat. Acad. Sci. 95 (25), 14863-14868 (1998).
- Davies, B. S. J., Rine, J. A Role for Sterol Levels in Oxygen Sensing in Saccharomyces cerevisiae. Genetik. 174 (1), 191-201 (2006).
- Meena, R. C., Kumar, N., Nath, S., Chakrabarti, A. Homologous Recombination is Activated at Early Time Points Following Exposure to Cobalt Chloride Induced Hypoxic Conditions in Saccharomyces cerevisiae. Ind. J. Microb. 52 (2), 209-214 (2012).
- Snoek, I. S. I., Tai, S. L., Pronk, J. T., Yde Steensma, H., Daran, J. -. M. Involvement of Snf7p and Rim101p in the transcriptional regulation of TIR1 and other anaerobically upregulated genes in Saccharomyces cerevisiae. FEMS Yeast Res. 10 (4), 367-384 (2010).
- Ellahi, A., Thurtle, D. M., Rine, J. The Chromatin and Transcriptional Landscape of Native Saccharomyces cerevisiae Telomeres and Subtelomeric Domains. Genetik. 200 (2), 505-521 (2015).
- Collart, M. A., Oliviero, S., et al. Preparation of yeast RNA. Curr. Prot. Mol. Biol. , (2001).
- Blankenberg, D., et al. Manipulation of FASTQ data with Galaxy. Bioinf. 24 (14), 1783-1785 (2010).
- Martini, P., et al. timeClip: pathway analysis for time course data without replicates. BMC Bioinf. 15, (2014).
- Oh, S., Song, S., Grabowski, G., Zhao, H., Noonan, J. P. Time series expression analyses using RNA-seq: a statistical approach. BioMed Res. Int. 2013, 1-16 (2013).
