Измерение уровня мРНК со временем во время дрожжей S. cerevisiae гипоксических ответа
Summary
Здесь мы представляем протокол, с помощью РНК seq для мониторинга уровня мРНК со временем во время гипоксических ответ S. cerevisiae клеток. Этот метод может быть адаптирована для анализа экспрессии генов в течение любого клеточного ответа.
Abstract
Сложные изменения в экспрессии генов посредником обычно большую часть клеточного ответа. Каждый ген может изменить выражение с уникальными кинетика как ген регулируется конкретного времени одной из многих раздражителей, сигнальные пути или вторичные эффекты. Для того, чтобы захватить весь ген выражение ответ к гипоксии в дрожжей S. cerevisiae, РНК seq анализ был использован для контроля уровня мРНК всех генов в определенное время после воздействия гипоксии. Гипоксия была создана путем выращивания клеток в ~ 100% N2 газ. Важно отметить, что в отличие от других гипоксических исследований, эргостерол и ненасыщенных жирных кислот не были добавлены в СМИ потому, что эти метаболиты влиять на экспрессию генов. Моменты времени были выбраны в диапазоне от 0 – 4 h после гипоксии, потому что этот период отражает значительные изменения в экспрессии генов. В каждый момент времени, середине журнала гипоксии клетки были быстро фильтруется и мороженые, ограничивая воздействие O2 и сопутствующие изменения в экспрессии генов. Общая РНК было извлечено из клеток и используется для обогащения для мРНК, который затем преобразуется cDNA. От этого cDNA мультиплекс библиотеки были созданы и восемь или более образцов были упорядочены в одной полосе секвенсор следующего поколения. Описан трубопровода после виртуализации, которая включает в себя базовый качества обрезки, читать картирования и определения количество считываний за гена. DESeq2 в пределах R статистики окружающей среды была использована для выявления генов, которые существенно изменить в любом из пунктов гипоксических время. Анализ трех биологических реплицирует показал высокую воспроизводимость, гены различных кинетики и большое количество O2-регулируется генов. Эти методы могут быть использованы для изучения, как клетки различных организмов реагировать гипоксии с течением времени и адаптированы для изучения экспрессии генов в ходе других клеточных реакций.
Introduction
Многих организмов реагировать гипоксии, или низкой O2, изменяя ген выражение 1,2,3. Этот ответ помогает справиться с отсутствием субстрата, решающее значение для аэробного дыхания и несколько биосинтетических реакций, но и с меняющейся окислительно-восстановительного состояния 4клетки. Несколько microarray исследования в S. cerevisiae показывают, что уровни mRNA сотен генов, изменения в ответ на гипоксии 5,6,,78,9 , 10 , 11 , 12. Недавно, РНК seq был использован для характеристики изменения выражения гена с течением времени при гипоксии 13. Здесь представлены экспериментальные данные и обсуждены.
Гипоксия может достигаться различными способами, каждая из которых производит другой уровень O2. Здесь, гипоксия была учреждена постоянно течет ультра высокой чистоты N2 в колбы, который понижает [O2] распущен сразу с воспроизводимые кинетики 10. Вполне возможно, что есть некоторые O2 молекулы настоящий влияющих на метаболизм и ген выражение, но эта среда считается очень недалеко от анаэробных. В отсутствие O2дрожжевых клеток не biosynthesize гема, эргостерол и ненасыщенных жирных кислот 4,12,14. Таким образом предыдущие исследования включили эти метаболиты, когда рост дрожжей без кислорода 5,10,15. Однако многие гипоксических ответы опосредовано истощения этих метаболитов и таким образом пополнения их меняет гипоксических ген выражение ответы 12,16. Чтобы имитировать природные гипоксии, эти метаболиты не были добавлены в средствах массовой информации. В короткое время, что клетки были подвержены гипоксии без присутствия этих основных метаболитов был не заметное увеличение гибели клеток (данные не показаны), ни длительного стресса ответ 13.
Ответ также зависит от напряжения и его генотипа. Особенно важными являются аллели известных регуляторы гипоксических ответы 2. Фон штамм S288C весьма желательно так, что результаты можно сравнить с другими геномных исследований, выполненных с этот штамм. Однако S288C содержит частичные потери функции аллеля HAP1 гена 17, транскрипционный анализ критических регулятор для гипоксических ответ. Эта аллеля было отремонтировано в S288C с помощью wildtype копии от Σ1278b штамма фон 11.
Экспрессия генов сильно зависит от клеточной среды. Таким образом при выполнении анализа генома общесистемной мРНК, важно поддерживать постоянный окружающей среды при различной еще один параметр, например время, стимул или генотипа. Для достижения высокой воспроизводимости результатов, рассмотрим эти три практики для исследования и все его биологических или технических реплицирует. Во-первых же experimenter(s) следует провести исследование, так как технической практики может различаться между экспериментаторов. Во-вторых той же партии ингредиентов должны использоваться в средствах массовой информации роста, как каждая партия имеет несколько иной состав, который может влиять на экспрессию генов. В-третьих чтобы свести к минимуму последствия клеточного цикла, каждый момент времени должна состоять из асинхронных клеток в середине журнала фазе роста (1-2 x 10-7 кл/мл).
При характеристике сложный ответ как ответ выражение гена к гипоксии, курс является выгодным для определения кинетика различных мероприятий. Конкретное время точек должен быть выбран, что будет захватить крупные изменения ответа. В этом исследовании были замечены время точек между 0 и 4 h, потому что последние эксперименты показали широко распространенные изменения в экспрессии генов в течение этого периода 13.
Для измерения глобального ген выражение, РНК seq был используется 18,19. Этот метод использует секвенирование нового поколения для определения относительного изобилия транскрипт каждого гена. По сравнению с microarray анализ ДНК, РНК seq экспонатов выше чувствительность (для выявления менее обильные стенограммы), более широкий динамический диапазон (для измерения более раз изменения) и Улучшенный воспроизводимости (чтобы точно следовать экспрессии генов с течением времени). Как правило наиболее клеточной РНК — рибосомной РНК, которые так много методов были разработаны для обогащения для конкретных видов РНК 20. Здесь поли T бусины были использованы для того чтобы очистить поли A-содержащих мРНК стенограммы, хотя различные коммерчески – доступные наборы истощения рРНК также может быть эффективным в мРНК обогащения.
Здесь характеризовался ответ выражение гена S. cerevisiae гипоксии. Клетки были подвержены гипоксии и затем отведать в восемь раз точки (0, 5, 10, 30, 60, 120, 180, 240 мин). Чтобы подтвердить воспроизводимость и выявления статистически измененные стенограммы, три биологических реплицирует были исполнены. РНК добытых столбец очистки и механические нарушения и затем обработаны для РНК seq анализа. Описан трубопровода после виртуализации и программирования сценариев предоставляются, которые позволяют выполнять точное репликации анализов. В частности Trimmomatic 21, TopHat2 22, HTseq 23, R статистической среды 24и DESeq2 пакет 25 были использованы для обработки данных, РНК seq и выявления 607 генов, которые существенно изменить во время гипоксия. Анализ главных компонент (СПС) и выражение гена реплицирует указали воспроизводимость метода. Кластеризация и карты показали широкое выражение кинетики, в то время как генная Онтология (GO) анализ показал, что многих клеточных процессах, как аэробного дыхания, обогащаются в наборе кислорода регулируется генов.
Protocol
Representative Results
Discussion
В этом исследовании уровни mRNA для всех генов был измерен при гипоксии в дрожжей S. cerevisiae. Целью было анализировать как глобальные изменения выражения гена из-за роста в контролируемой среде, вблизи аноксии. Некоторые шаги были приняты для обеспечения тщательно контролируемых и вос?…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Мы благодарим Льюис-Сиглер Институт интегративной геномики последовательности основного фонда в Принстонском университете для технических консультаций и подготовки библиотеки РНК и последовательности. Эта работа была поддержана грантов от Университет Роуэна и низ NIGMS R15GM113187 M.J.H.
Materials
| Enclosed dry incubator | Thermo Scientific | MaxQ 4000 | Set at 30°C. Modify the door to allow entry of one Tygon tube. Alternatively, use the New Brunswick G25 incubator, which contains a tube port. Do not use an open-air water shaker, as condensation will collect in the tubes between flasks, possibly cross-contaminating cultures. |
| Micro-analysis Filter Holder | Millipore | XX1002530 | 25mm diameter, stainless steel support, no. 5 perforated silicone stopper mounts in standard 125mL filtering flask |
| Strong vacuum | Edwards | E-LAB 2 | The “house” vacuum may be too weak. Alternatively, use an electric-power portable vacuum pump like the one listed here. |
| 1000-mL flask | To act as vacuum trap. | ||
| ~2-foot lengths of Heavy Wall Vacuum Tubing, inner diameter 3/8 in, outer diameter 7/8 in | Tygon | 38TT | Two pieces: the first connects vacuum to trap, and the second connects trap to filter system. |
| High-pressure N2 gas tank | 99.999% purity, >1000psi, with a regulator and gas flow controller | ||
| Autoclaved 500mL flask | Opening covered with aluminum foil. One for each yeast strain. | ||
| Autoclaved 250mL flasks | Openings covered with aluminum foil. One for each time point plus two for water traps. | ||
| Flask stoppers (size 6, two holes with 5mm diameter) | Sterilized with 70% ethanol. One for each flask. | ||
| Glass tubing, length 9 cm or 17 cm, inner diameter 2 mm, outer diameter 5 mm | Sterilized with 70% ethanol. Two tubes for each flask. Place into the holes of each stopper. See Figure 1 for placement of 9- vs 17- cm tubes. | ||
| ~25-cm lengths of plastic tubing, inner diameter 5 mm | Tygon | E-3603 | One piece for each flask. Sterilized with 70% ethanol. |
| Sterile filter discs | Millipore | HAWP02500 | 25mm diameter, 0.45 µm pore size, one for each time point |
| Sterile dH2O (~100mL) | |||
| 1-mL cuvettes | For measuring OD600 (i.e., cell concentration) | ||
| 50-mL sterile centrifuge tubes | One for each time point | ||
| Clean and sterile tweezers | |||
| liquid nitrogen | For freezing cells | ||
| acid-washed beads | Sigma | G8772 | Keep at 4°C for lysing cells |
| Qiagen RNeasy Mini Kit | Qiagen | 74104 | For RNA column purification |
| Qiagen RLT buffer | Prepare by adding 10µL of β-Mercaptoethanol per 1mL of RLT buffer, keep at 4C. | ||
| 2-mL collection tubes | Qiagen | included in the Qiagen Rneasy Mini Kit | |
| Buffer RPE | Qiagen | included in the Qiagen Rneasy Mini Kit | |
| Buffer RW1 | Qiagen | included in the Qiagen Rneasy Mini Kit | |
| DNase I stock and working solutions | Qiagen | 79254 | The DNase I enzyme comes as lyophilized powder in a glass vial. Using a sterile needle and syringe, inject 550µL of RNase-free water (provided in Qiagen kit) into the vial. Mix by gently inverting the bottle. To avoid denaturing the enzyme, do not vortex. Using a pipet, remove this stock solution from the vial and store in freezer (-20°C) in single-use aliquots (80µL each). The stock solution should not be thawed and refrozen. |
| Buffer RDD | Qiagen | included in the Qiagen DNase Kit | |
| Ice cold 2-mL screw-cap tubes | For lysing cells during RNA extraction | ||
| bead mill homogenizer | Biospec Mini-Beadbeater-24 | 112011 | Keep in cold room |
| Bacto Peptone | BD | DF0118 | for liquid YPD media |
| Bacto Yeast Extract | BD | DF0886 | for liquid YPD media |
| glucose | Fisher | D16 | for liquid YPD media |
| Qubit assay tubes | Thermo Fisher | Q32856 | for measuring nucleic acid concentration |
| Quant-iTTM dsDNA BR Assay Kit | Thermo Fisher | Q32853 | for measuring nucleic acid concentration |
| Quant-iTTM RNA Assay Kit | Thermo Fisher | Q32855 | for measuring nucleic acid concentration |
| Qubit Fluorometer | Thermo Fisher | Q33216 | for measuring nucleic acid concentration |
| Commercial electrophoresis system | Agilent | Bioanalyzer 2100 | for measuring nucleic acid quality |
| Next-generation sequencer | Illumina | HiSeq 2500 | for sequencing libraries |
| automated liquid handling system | Wafergen | Apollo 324 | for creating sequencing libraries |
| PrepX PolyA mRNA Isolation Kit | Wafergen | 400047 | for isolating mRNA from total RNA |
| PrepX RNA SEQ for Illumina Library Kit | Wafergen | 400039 | for creating strand-specific sequencing libraries from total RNA |
| Barcode Splitter | https://toolshed.g2.bx.psu.edu/repository?repository_id=7119c4f7a89efa57&changeset_revision=e7b7cdc1834d | ||
| Samtools, which includes the gzip command | http://www.htslib.org/download/ | ||
| Trimmomatic | http://www.usadellab.org/cms/?page=trimmomatic | ||
| Bowtie2 (installed before TopHat) | http://bowtie-bio.sourceforge.net/bowtie2/index.shtml | ||
| TopHat | https://ccb.jhu.edu/software/tophat/index.shtml | ||
| HTSeq | http://www-huber.embl.de/HTSeq/doc/overview.html | ||
| R (installed before R Studio) | https://cran.rstudio.com | ||
| R Studio (free version) | https://www.rstudio.com/products/rstudio/download/ |
Referenzen
- Semenza, G. L. Oxygen sensing, homeostasis, and disease. New Eng. J Med. 365 (6), 537-547 (2011).
- Butler, G. Hypoxia and gene expression in eukaryotic microbes. Annu. Rev. Micro. 67, 291-312 (2013).
- Ratcliffe, P. J. Oxygen sensing and hypoxia signalling pathways in animals: the implications of physiology for cancer. J. Physiol. 591 (Pt 8), 2027-2042 (2013).
- Rosenfeld, E., Beauvoit, B. Role of the non-respiratory pathways in the utilization of molecular oxygen bySaccharomyces cerevisiae. Yeast. 20 (13), 1115-1144 (2003).
- Ter Linde, J. J., et al. Genome-wide transcriptional analysis of aerobic and anaerobic chemostat cultures of Saccharomyces cerevisiae. J. Bacteriol. 181 (24), 7409-7413 (1999).
- Ter Linde, J. J., Steensma, H. Y. A microarray-assisted screen for potential Hap1 and Rox1 target genes in Saccharomyces cerevisiae. Yeast. 19 (10), 825-840 (2002).
- Kwast, K. E., et al. Genomic analyses of anaerobically induced genes in Saccharomyces cerevisiae: functional roles of Rox1 and other factors in mediating the anoxic response. J. Bacteriol. 184 (1), 250-265 (2002).
- Becerra, M., et al. The yeast transcriptome in aerobic and hypoxic conditions: effects of hap1, rox1, rox3 and srb10 deletions. Mol. Microbiol. 43 (3), 545-555 (2002).
- Lai, L. -. C., Kosorukoff, A. L., Burke, P. V., Kwast, K. E. Dynamical remodeling of the transcriptome during short-term anaerobiosis in Saccharomyces cerevisiae: differential response and role of Msn2 and/or Msn4 and other factors in galactose and glucose media. Mol. Cell. Biol. 25 (10), 4075-4091 (2005).
- Lai, L. C., Kosorukoff, A. L., Burke, P. V., Kwast, K. E. Metabolic-State-Dependent Remodeling of the Transcriptome in Response to Anoxia and Subsequent Reoxygenation in Saccharomyces cerevisiae. Euk. Cell. 5 (9), 1468-1489 (2006).
- Hickman, M. J., Winston, F. Heme levels switch the function of Hap1 of Saccharomyces cerevisiae between transcriptional activator and transcriptional repressor. Mol. Cell. Biol. 27 (21), 7414-7424 (2007).
- Hickman, M. J., Spatt, D., Winston, F. The Hog1 mitogen-activated protein kinase mediates a hypoxic response in Saccharomyces cerevisiae. Genetik. 188 (2), 325-338 (2011).
- Bendjilali, N., et al. Time-Course Analysis of Gene Expression During the Saccharomyces cerevisiae Hypoxic Response. G3. 7 (1), 221-231 (2017).
- Chellappa, R., et al. The membrane proteins, Spt23p and Mga2p, play distinct roles in the activation of Saccharomyces cerevisiae OLE1 gene expression. Fatty acid-mediated regulation of Mga2p activity is independent of its proteolytic processing into a soluble transcription activator. J. Biol. Chem. 276 (47), 43548-43556 (2001).
- Abramova, N. E., et al. Regulatory mechanisms controlling expression of the DAN/TIR mannoprotein genes during anaerobic remodeling of the cell wall in Saccharomyces cerevisiae. Genetik. 157 (3), 1169-1177 (2001).
- Hughes, A. L., Todd, B. L., Espenshade, P. J. SREBP Pathway Responds to Sterols and Functions as an Oxygen Sensor in Fission Yeast. Cell. 120 (6), 831-842 (2005).
- Gaisne, M., Bécam, A. M., Verdière, J., Herbert, C. J. A "natural" mutation in Saccharomyces cerevisiae strains derived from S288c affects the complex regulatory gene HAP1 (CYP1). Curr. Gen. 36 (4), 195-200 (1999).
- Wang, Z., Gerstein, M., Snyder, M. RNA-Seq: a revolutionary tool for transcriptomics. Nat. Rev. Gen. 10 (1), 57-63 (2009).
- Anders, S., Huber, W. Differential expression analysis for sequence count data. Genome Biol. 11 (10), R106 (2010).
- Conesa, A., et al. A survey of best practices for RNA-seq data analysis. Genome Biol. 17 (1), 13 (2016).
- Bolger, A. M., Lohse, M., Usadel, B. Trimmomatic: a flexible trimmer for Illumina sequence data. Bioinf. 30 (15), 2114-2120 (2014).
- Kim, D., Pertea, G., Trapnell, C., Pimentel, H., Kelley, R., Salzberg, S. L. TopHat2: accurate alignment of transcriptomes in the presence of insertions, deletions and gene fusions. Genome Biol. 14 (4), R36 (2013).
- Anders, S., Pyl, P. T., Huber, W. HTSeq–A Python framework to work with high-throughput sequencing data. Bioinf. 31 (2), 166-169 (2015).
- . R: A Language and Environment for Statistical Computing Available from: https://www.R-project.org (2015)
- Love, M. I., Huber, W., Anders, S. Moderated estimation of fold change and dispersion for RNA-seq data with DESeq2. Genome Biol. 15 (12), 550 (2014).
- Brown, T., Mackey, K., Du, T. Analysis of RNA by Northern and Slot Blot Hybridization. Curr. Prot. Mol. Biol. 74, 4.9.1-4.9.19 (2004).
- Edgar, R., Domrachev, M., Lash, A. E. Gene Expression Omnibus: NCBI gene expression and hybridization array data repository. Nuc. Acids Res. 30 (1), 207-210 (2002).
- Cherry, J. M., et al. Saccharomyces Genome Database: the genomics resource of budding yeast. Nuc. Acids Res. 40, D700-D705 (2012).
- Hothorn, T., Everitt, B. S. . A Handbook of Statistical Analyses using R. , (2014).
- Saldanha, A. J. Java Treeview–extensible visualization of microarray data. Bioinformatics. 20 (17), 3246-3248 (2004).
- Eisen, M. B., Spellman, P. T., Brown, P. O., Botstein, D. Cluster analysis and display of genome-wide expression patterns. Proc. Nat. Acad. Sci. 95 (25), 14863-14868 (1998).
- Davies, B. S. J., Rine, J. A Role for Sterol Levels in Oxygen Sensing in Saccharomyces cerevisiae. Genetik. 174 (1), 191-201 (2006).
- Meena, R. C., Kumar, N., Nath, S., Chakrabarti, A. Homologous Recombination is Activated at Early Time Points Following Exposure to Cobalt Chloride Induced Hypoxic Conditions in Saccharomyces cerevisiae. Ind. J. Microb. 52 (2), 209-214 (2012).
- Snoek, I. S. I., Tai, S. L., Pronk, J. T., Yde Steensma, H., Daran, J. -. M. Involvement of Snf7p and Rim101p in the transcriptional regulation of TIR1 and other anaerobically upregulated genes in Saccharomyces cerevisiae. FEMS Yeast Res. 10 (4), 367-384 (2010).
- Ellahi, A., Thurtle, D. M., Rine, J. The Chromatin and Transcriptional Landscape of Native Saccharomyces cerevisiae Telomeres and Subtelomeric Domains. Genetik. 200 (2), 505-521 (2015).
- Collart, M. A., Oliviero, S., et al. Preparation of yeast RNA. Curr. Prot. Mol. Biol. , (2001).
- Blankenberg, D., et al. Manipulation of FASTQ data with Galaxy. Bioinf. 24 (14), 1783-1785 (2010).
- Martini, P., et al. timeClip: pathway analysis for time course data without replicates. BMC Bioinf. 15, (2014).
- Oh, S., Song, S., Grabowski, G., Zhao, H., Noonan, J. P. Time series expression analyses using RNA-seq: a statistical approach. BioMed Res. Int. 2013, 1-16 (2013).
