효 모 S. cerevisiae Hypoxic 응답 하는 동안 시간이 지남에 mRNA 수준 측정

Summary

여기, 우리를 mRNA 수준 S. cerevisiae 세포의 hypoxic 응답 시간 모니터링 RNA-seq를 사용 하 여 프로토콜을 제시. 이 메서드는 어떤 세포 응답 중 유전자 발현 분석을 적용할 수 있습니다.

Abstract

유전자 발현에 복잡 한 변화는 일반적으로 상당 부분의 세포 응답 중재. 유전자는 많은 자극, 신호 경로 또는 보조 효과 중의 특정 타이밍에 의해 규제로 각 진 독특한 속도 식을 변경할 수 있습니다. 전체 유전자를 캡처하기 위해 식 응답 효 모 S. cerevisiae, RNA-seq 분석에서에서 hypoxia 저 산소 증에 노출 된 후 특정 시간에 모든 유전자의 mRNA 레벨을 모니터링 하는 데 사용 되었다. Hypoxia 성장 셀 ~ 100% N₂ 가스에 의해 설립 되었다. 중요 한 것은, 다른 hypoxic 연구와 달리 ergosterol 및 불포화 지방산 했다에 추가 되지 미디어 이러한 대사 유전자 발현에 영향을 때문에. 시간 포인트는 0-4 h 저 산소 증 후의 범위에서 그 기간 캡처 유전자 발현에 있는 중요 한 변화 때문에 선정 됐다. 각 시간 지점에서 중간 로그 hypoxic 세포 했다 신속 하 게 필터링 하 고 냉동, O₂ 와 수 반하는 변화 유전자 발현에 대 한 노출을 제한. 총 RNA 세포에서 추출 하 고 mRNA를 cDNA 다음 변환 되었습니다에 대 한 풍부 하 게 사용 했다. 이 cDNA에서 멀티플렉스 라이브러리 생성 하 고 8 개 이상의 샘플 다음-세대 시퀀서의 한 차선에 순서가 되었다. 품질 기본 트리밍, 매핑 및 결정 하는 유전자 당 읽기 수를 포함 하 후 시퀀싱 파이프라인은 기술 된다. R 통계 환경 내에서 DESeq2 hypoxic 시간 포인트 중 하나에 크게 변경 하는 유전자를 식별 하기 위해 사용 되었다. 3 생물 복제의 분석 공개 높은 재현성, 다른 활동의 유전자와 많은 수의 예상 O₂-유전자 통제. 이러한 방법은 시간이 지남에 다양 한 생물의 세포 저 산소 증에 대처 하는 방법을 연구 하는 데 사용 하 고 다른 세포 응답 중 유전자 발현 연구에 맞게 수 있습니다.

Introduction

많은 유기 체는 유전자 식 ^1,2,3을 변경 하 여 저 산소 증, 또는 낮은 O₂에 응답. 이 응답 세포 변화 산화 상태 ⁴뿐만 아니라 호 기성 호흡에 대 한 몇 가지 생 합성 반응에 대 한 중요 기판의 부족을 극복할 수 있습니다. S. cerevisiae 에서 수행 하는 여러 microarray 연구 보여 수백 개의 유전자의 mRNA 수준 응답 hypoxia ^5,6,7,,89 으로 변경 ^{, 10 , 11 , 12}. 최근, RNA-seq hypoxia ¹³중 시간이 지남에 따라 진 식 변화 하 사용 되었다. 여기, 실험 내용을 제시 하 고 논의.

다양 한 방법으로, 각각 생산 하는 O₂의 다른 수준에 산소를 얻을 수 있습니다. 여기, hypoxia 지속적으로 흐르는 의해 설립 초 고 순도 N₂ 플라스 크로 낮추고 [O₂] 해산 즉시 재현할 수 활동 ¹⁰. 그것은 가능한 일부 O₂ 분자 현재 신진 대사 및 유전자 표현에 기여 하는 하지만이 환경은 혐 기성에 가까운 매우 간주 됩니다. O₂의 부재, 효 모 세포 biosynthesize heme, ergosterol 및 불포화 지방산 ^4,,1214수 없습니다. 따라서, 이전 연구 산소 ^5,,1015없이 효 모 성장 하는 때이 대사 산물을 포함 했다. 그러나, 많은 hypoxic 응답이 대사이 산물의 고갈에 의해 중재 되 고 hypoxic 유전자 식 응답 ^12,16반전 따라서 그들을 보충. 자연 산소를 모방 하기 위해이 대사 되지 미디어에 추가 되었습니다. 셀이 필수적인 metabolites의 존재 없이 산소에 노출 됐다 짧은 시간에 세포 죽음 (데이터 표시 되지 않음)도 장기간된 스트레스 응답 ¹³에 눈에 띄게 증가 했다.

응답은 또한 긴장과 그 유전자 형에 의존 합니다. 특히 중요 한 hypoxic 응답 ²의 알려진된 레 귤 레이 터의 대립 이다. S288C 변형 배경은 매우이 긴장으로 수행 다른 게놈 연구에 결과 비교 될 수 있다 그래야 원한다. 그러나, S288C 부분적인 손실의 기능 대립 유전자는 HAP1 유전자 ¹⁷, hypoxic 응답에 대 한 중요 한 transcriptional 규칙을 포함합니다. 이 대립 유전자 S288C에 수리는 wildtype를 사용 하 여 복사는 Σ1278b에서 변형 배경 ¹¹.

유전자 발현은 세포 환경에 매우 의존 합니다. 따라서, 게놈 넓은 mRNA 분석을 수행할 때 시간, 자극, 유전자 형 등 다른 매개 변수를 변화 하는 동안 일정 한 환경을 유지 하는 것이 중요 하다. 높은 재현성 결과 얻기 위해 연구에 대 한이 세 가지 사례와 모든 생물 학적 또는 기술적인 복제를 고려 하십시오. 첫째, 동일한 experimenter(s) 기술 사례 경험에 걸쳐 다를 수 있습니다 이후 연구를 수행 한다. 둘째, 각 일괄 처리는 유전자 발현에 영향을 줄 수 있는 약간 다른 구성 성분의 동일한 배치 성장 매체에 사용 되어야 한다. 셋째, 세포 주기 효과 최소화 하기 위해 각 시간 포인트는 성장 (1-⁷ 셀/10ml x 2)의 중간 로그 단계에서 비동기 셀로 이루어져야 합니다.

Hypoxia에 유전자 식 응답과 같은 복잡 한 응답을 특성화 때 시간 코스의 다양 한 이벤트 활동을 결정 하는 데 유리 하다. 그 응답의 큰 변화를 사로잡을 것입니다 특정 시간 포인트를 선택 합니다. 본이 연구에서는 과거 실험 공개 유전자 발현이 기간 ¹³동안에 광범위 하 게 변화 하기 때문에 0와 4 h 사이 시간 포인트 관찰 되었다.

측정 하려면 글로벌 유전자 발현, RNA-seq 사용된 ^18,19이었다. 이 방법은 각 유전자의 사본의 관계 되는 풍부를 결정 하기 위해 차세대 시퀀싱을 사용 합니다. DNA microarray 분석에 비해, RNA-seq 높은 감도 (탐지 덜 풍부한 성적 증명서), 큰 동적 범위 (큰 배 변화를 측정) 및 (정확 하 게 유전자 발현 시간이 지남에 따라)에 우수한 재현성을 전시 한다. 일반적으로, 가장 세포질 RNA 리보솜 RNA 특정 RNA 종 ²⁰에 대 한 풍부 하 게 개발 되었습니다 너무 많은 방법 이다. 여기, 폴 리-T 구슬 정화 폴 리 A 포함 된 mRNA 사본, 하지만 다양 한 상업적으로 사용 되었다-사용 가능한 rRNA 고갈 키트 mRNA 풍부에도 효과적일 수 있습니다.

여기, S. cerevisiae 유전자 식 응답 저 산소 증으로 특징 이었다. 세포 저 산소 증에 노출 되었고 다음 8 시간 지점에서 샘플링 (0, 5, 10, 30, 60, 120, 180, 240 분). 재현성을 확인 하 고 통계적으로 변경된 증명서를 확인 하 세 생물 복제 수행 했다. RNA는 기계적 장애 및 열 정화, 추출 하 고 RNA-seq 분석에 대 한 처리. -시퀀싱 파이프라인을 설명 하 고 프로그래밍 스크립트 수 있는 제공 됩니다 분석의 정확한 복제 수행. 특히, Trimmomatic ²¹, TopHat2 ²², HTseq ²³, ²⁴R 통계 환경 그리고 DESeq2 패키지 ²⁵ 사용 되었다 RNA-seq 데이터를 처리 하 고 기간 동안 크게 변경 607 유전자를 식별 하 저 산소 증입니다. 주성분 분석 (PCA)와 복제의 유전자 발현 기술의 재현성을 표시. 클러스터링 및 heatmaps 유전자 존재론 (가십시오) 분석 많은 세포질 과정, 호 기성 호흡 처럼 풍성 하 게 산소 통제 유전자의 세트에서 보였다 동안 광범위 한 식 속도 론을, 계시 했다.

Protocol

1. 저 산소 증 유도 1 일 이상 hypoxia 시간 코스 하기 전에: 인큐베이터를 준비, 필터링 시스템, 진공, 가스 탱크, 플라스 크, stoppers, 유리 튜브와 튜브, 자료 테이블에서. 셀의 빠른 처리에 가까운 근접에서 N2 탱크, 인큐베이터, 진공 및 필터링 시스템을 놓습니다. 유리 병에 압력가 마로 소독 구성 요소를 혼합 하 여 살 균 액체 YPD 미디어 (1% 효 모 추출, 2% 펩…

Representative Results

Hypoxia 시간 과정 및 RNA-seq 분석 세 번 독립적으로 수행 했다. 3 복제의 재현성 검사, 유전자 표현 데이터 모든 유전자에 대 한 주요 구성 요소 분석 (PCA)를 사용 하 여 분석 했다. 그림 2 는 샘플 함께의 58.9%를 대표 하는 첫 번째 두 개의 주요 구성 요소를 통해 변경 하는 방법을 보여 줍니다. 이 분석 표시 각 시간 과정 (와 같이 각 곡선의 비슷한 모양) 이…

Discussion

이 연구에서는 모든 유전자에 대 한 mRNA 수준 효 모 S. cerevisiae에서 hypoxia 동안 측정 되었다. 목표 근처 무산 소 환경에서 증가로 어떻게 세계적인 유전자 표현 변화를 분석 했다. 몇 가지 단계는 여기서 설명 하는 방법을 신중 하 게 제어 하 고 재현할 수 있었다는 촬영 했다. 첫째, 세포는 정확 하 게 정의 된 hypoxic 환경에 노출 되었다: 리치 미디어 (YPD)에서 99.999% N₂ . 저 산소 증의 다?…

Materials

Enclosed dry incubator	Thermo Scientific	MaxQ 4000	Set at 30°C. Modify the door to allow entry of one Tygon tube. Alternatively, use the New Brunswick G25 incubator, which contains a tube port. Do not use an open-air water shaker, as condensation will collect in the tubes between flasks, possibly cross-contaminating cultures.
Micro-analysis Filter Holder	Millipore	XX1002530	25mm diameter, stainless steel support, no. 5 perforated silicone stopper mounts in standard 125mL filtering flask
Strong vacuum	Edwards	E-LAB 2	The “house” vacuum may be too weak. Alternatively, use an electric-power portable vacuum pump like the one listed here.
1000-mL flask			To act as vacuum trap.
~2-foot lengths of Heavy Wall Vacuum Tubing, inner diameter 3/8 in, outer diameter 7/8 in	Tygon	38TT	Two pieces: the first connects vacuum to trap, and the second connects trap to filter system.
High-pressure N2 gas tank			99.999% purity, >1000psi, with a regulator and gas flow controller
Autoclaved 500mL flask			Opening covered with aluminum foil. One for each yeast strain.
Autoclaved 250mL flasks			Openings covered with aluminum foil. One for each time point plus two for water traps.
Flask stoppers (size 6, two holes with 5mm diameter)			Sterilized with 70% ethanol. One for each flask.
Glass tubing, length 9 cm or 17 cm, inner diameter 2 mm, outer diameter 5 mm			Sterilized with 70% ethanol. Two tubes for each flask. Place into the holes of each stopper. See Figure 1 for placement of 9- vs 17- cm tubes.
~25-cm lengths of plastic tubing, inner diameter 5 mm	Tygon	E-3603	One piece for each flask. Sterilized with 70% ethanol.
Sterile filter discs	Millipore	HAWP02500	25mm diameter, 0.45 µm pore size, one for each time point
Sterile dH2O (~100mL)
1-mL cuvettes			For measuring OD600 (i.e., cell concentration)
50-mL sterile centrifuge tubes			One for each time point
Clean and sterile tweezers
liquid nitrogen			For freezing cells
acid-washed beads	Sigma	G8772	Keep at 4°C for lysing cells
Qiagen RNeasy Mini Kit	Qiagen	74104	For RNA column purification
Qiagen RLT buffer			Prepare by adding 10µL of β-Mercaptoethanol per 1mL of RLT buffer, keep at 4C.
2-mL collection tubes	Qiagen		included in the Qiagen Rneasy Mini Kit
Buffer RPE	Qiagen		included in the Qiagen Rneasy Mini Kit
Buffer RW1	Qiagen		included in the Qiagen Rneasy Mini Kit
DNase I stock and working solutions	Qiagen	79254	The DNase I enzyme comes as lyophilized powder in a glass vial. Using a sterile needle and syringe, inject 550µL of RNase-free water (provided in Qiagen kit) into the vial. Mix by gently inverting the bottle. To avoid denaturing the enzyme, do not vortex. Using a pipet, remove this stock solution from the vial and store in freezer (-20°C) in single-use aliquots (80µL each). The stock solution should not be thawed and refrozen.
Buffer RDD	Qiagen		included in the Qiagen DNase Kit
Ice cold 2-mL screw-cap tubes			For lysing cells during RNA extraction
bead mill homogenizer	Biospec Mini-Beadbeater-24	112011	Keep in cold room
Bacto Peptone	BD	DF0118	for liquid YPD media
Bacto Yeast Extract	BD	DF0886	for liquid YPD media
glucose	Fisher	D16	for liquid YPD media
Qubit assay tubes	Thermo Fisher	Q32856	for measuring nucleic acid concentration
Quant-iTTM dsDNA BR Assay Kit	Thermo Fisher	Q32853	for measuring nucleic acid concentration
Quant-iTTM RNA Assay Kit	Thermo Fisher	Q32855	for measuring nucleic acid concentration
Qubit Fluorometer	Thermo Fisher	Q33216	for measuring nucleic acid concentration
Commercial electrophoresis system	Agilent	Bioanalyzer 2100	for measuring nucleic acid quality
Next-generation sequencer	Illumina	HiSeq 2500	for sequencing libraries
automated liquid handling system	Wafergen	Apollo 324	for creating sequencing libraries
PrepX PolyA mRNA Isolation Kit	Wafergen	400047	for isolating mRNA from total RNA
PrepX RNA SEQ for Illumina Library Kit	Wafergen	400039	for creating strand-specific sequencing libraries from total RNA
Barcode Splitter			https://toolshed.g2.bx.psu.edu/repository?repository_id=7119c4f7a89efa57&changeset_revision=e7b7cdc1834d
Samtools, which includes the gzip command			http://www.htslib.org/download/
Trimmomatic			http://www.usadellab.org/cms/?page=trimmomatic
Bowtie2 (installed before TopHat)			http://bowtie-bio.sourceforge.net/bowtie2/index.shtml
TopHat			https://ccb.jhu.edu/software/tophat/index.shtml
HTSeq			http://www-huber.embl.de/HTSeq/doc/overview.html
R (installed before R Studio)			https://cran.rstudio.com
R Studio (free version)			https://www.rstudio.com/products/rstudio/download/