Misurazione dei livelli di mRNA nel tempo durante la risposta Hypoxic lievito s. cerevisiae
Summary
Qui, presentiamo un protocollo utilizzando RNA-seq per monitorare i livelli di mRNA nel tempo durante la risposta hypoxic delle cellule di S. cerevisiae . Questo metodo può essere adattato per l’analisi di espressione genica durante qualsiasi risposta cellulare.
Abstract
Complessi cambiamenti nell’espressione genica mediano in genere una grande porzione di una risposta cellulare. Ogni gene può cambiare espressione con la cinetica unico come il gene è regolato tramite la sincronizzazione particolare di uno dei molti stimoli, segnalazione vie o effetti secondari. Al fine di catturare l’intero gene espressione risposta all’ipossia nel lievito S. cerevisiae, analisi di RNA-seq è stata usata per monitorare i livelli di mRNA di geni tutti in momenti specifici dopo l’esposizione all’ipossia. L’ipossia è stato stabilito coltivando cellule in ~ 100% N2 gas. Cosa importante, a differenza di altri studi hypoxic, ergosterolo e acidi grassi insaturi non sono stati aggiunti ai media perché questi metaboliti influenzano l’espressione genica. Intervalli di tempo sono stati scelti nella gamma di 0 – 4 h dopo ipossia perché quel periodo acquisisce i principali cambiamenti nell’espressione genica. In ogni punto del tempo, le cellule hypoxic Mid-registro erano rapidamente filtrata e congelati, limitando l’esposizione di O2 e concomitanti cambiamenti nell’espressione genica. RNA totale è stato estratto dalle cellule e utilizzato per arricchire per mRNA, che è stato poi convertito in cDNA. Da questo cDNA, multisala librerie sono state create e otto o più campioni sono stati sequenziati in una corsia di un sequencer di prossima generazione. Una pipeline di post-sequenziamento è descritta, che include guarnizione base di qualità, leggere mapping e determinazione del numero di letture al gene. DESeq2 all’interno dell’ambiente statistico R è stato utilizzato per identificare i geni che cambiano significativamente in uno qualsiasi dei punti tempo ipossica. Analisi di tre replicati biologici ha rivelato alta riproducibilità, geni della cinetica differente e un gran numero di previsto O2-regolato geni. Questi metodi possono essere utilizzati per studiare come le cellule di vari organismi rispondono all’ipossia nel tempo e adattati per lo studio di espressione genica durante altre risposte cellulari.
Introduction
Molti organismi rispondono all’ipossia, o basso O2, alterando gene expression 1,2,3. Questa risposta aiuta le cellule a fronte della mancanza di un substrato fondamentale per la respirazione aerobica e per parecchie reazioni biosintetiche, ma anche con un cambiamento di stato redox 4. Parecchi studi di microarray eseguiti in S. cerevisiae mostrano che i livelli di mRNA di centinaia di geni cambiano in risposta all’ipossia 5,6,7,8,9 , 10 , 11 , 12. recentemente, RNA-seq è stata utilizzata per caratterizzare i cambiamenti di espressione genica nel corso del tempo durante l’ipossia 13. Qui, i dettagli sperimentali sono presentati e discussi.
L’ipossia può essere realizzato in vari modi, ciascuno producendo un diverso livello di O2. Qui, l’ipossia è stato stabilito dal continuo fluire ultra-alto-purezza N2 in boccette, che abbassa [O2] dissolto immediatamente con cinetica riproducibile 10. È possibile che ci sono alcune molecole di2 O presenti che contribuiscono al metabolismo e nell’espressione genica ma questo ambiente è considerato molto vicino anaerobica. In assenza di O2, cellule di lievito non possono biosintetizzare eme, ergosterolo e acidi grassi insaturi 4,12,14. Così, gli studi precedenti hanno incluso questi metaboliti quando crescente lievito senza ossigeno 5,10,15. Tuttavia, molte risposte ipossiche sono mediate da svuotamento di questi metaboliti e così loro reintegro inverte il gene hypoxic espressione risposte 12,16. Al fine di imitare naturale ipossia, questi metaboliti non sono stati aggiunti ai media. Nel breve tempo che le cellule sono state esposte all’ipossia senza la presenza di questi metaboliti essenziali, non c’era nessun notevole aumento della morte cellulare (dati non mostrati) né una risposta di stress prolungato 13.
La risposta dipende anche il ceppo e il suo genotipo. Particolarmente importanti sono gli alleli dei regolatori noti di risposte ipossiche 2. Sullo sfondo di ceppo S288C è altamente desiderato in modo che risultati possono essere confrontati agli altri studi genomici eseguite con questo ceppo. Tuttavia, S288C contiene un allele di perdita-de-funzione parziale del HAP1 gene 17, un regolatore trascrizionale critico per la risposta hypoxic. Questo allele è stato riparato in S288C utilizzando un wildtype copia dal Σ1278b ceppo sfondo 11.
Espressione genica è altamente dipendente l’ambiente cellulare. Così, quando si esegue l’analisi del mRNA di genoma, è importante mantenere un ambiente costante pur variando un altro parametro come tempo, stimolo o genotipo. Per ottenere risultati altamente riproducibili, considera queste tre pratiche per lo studio e tutte le sue repliche biologiche o tecnici. In primo luogo, il experimenter(s) stesso dovrebbe svolgere lo studio, poiché pratiche tecniche possono variare tra gli sperimentatori. In secondo luogo, la stessa serie di ingredienti da utilizzarsi nei media crescita quanto ogni partita ha una composizione leggermente differente che possa influenzare l’espressione genica. In terzo luogo, per ridurre al minimo gli effetti del ciclo cellulare, ogni punto di tempo dovrebbe consistere asincrone cellule nella fase di Mid-registro di crescita (1-2 x 107 cellule/mL).
Quando che caratterizzano una risposta complessa come la risposta di espressione genica all’ipossia, un corso di tempo è vantaggioso per determinare la cinetica di vari eventi. Intervalli di tempo specifici dovrebbero essere scelti che catturerà i principali cambiamenti della risposta. In questo studio, sono stati osservati punti di tempo compreso tra 0 e 4 h, perché ultimi esperimenti ha rivelato i cambiamenti diffusi nell’espressione genica durante questo periodo 13.
Per misurare l’espressione genica globale, RNA-seq è stato usato 18,19. Questo metodo utilizza il sequenziamento di nuova generazione per determinare l’abbondanza relativa di trascrizione di ogni gene. Rispetto all’analisi di microarray del DNA, il RNA-seq esibisce maggiore sensibilità (per rilevare le trascrizioni meno abbondanti), una maggiore gamma dinamica (per misurare le variazioni di piega maggiore) e riproducibilità superiore (a seguire con precisione l’espressione genica nel corso del tempo). In genere, più cellulare del RNA è RNA ribosomiale così molti metodi sono stati sviluppati per arricchire per specifici RNA specie 20. Qui, poli-T sfere sono stati utilizzati per purificare poli-A-contenenti trascrizioni del mRNA, però i vari commercialmente – Kit di svuotamento di rRNA disponibili potrebbe anche essere efficace nel arricchimento di mRNA.
Qui, la risposta di espressione del gene di S. cerevisiae all’ipossia è stata caratterizzata. Le cellule erano esposti ad ipossia e poi provate a otto punti di tempo (0, 5, 10, 30, 60, 120, 180 e 240 min). Per confermare la riproducibilità e per identificare le trascrizioni statisticamente modificate, sono stati effettuati tre replicati biologici. RNA è stato estratte da rottura meccanica e purificazione di colonna e poi elaborato per l’analisi di RNA-seq. La pipeline di post-sequenziamento è descritta e sono gli script di programmazione che consentono di eseguire la replica esatta delle analisi. In particolare, Trimmomatic 21, TopHat2 22, HTseq 23, l’ ambiente statistico R 24e il DESeq2 pacchetto 25 sono stati utilizzati per elaborare i dati di RNA-seq e per identificare 607 geni che cambiano in modo significativo durante ipossia. Analisi delle componenti principali (PCA) e l’espressione genica dei replicati indicato la riproducibilità della tecnica. Clustering e heatmaps ha rivelato la cinetica di espressione ad ampio raggio, mentre l’analisi del gene ontology (GO) ha mostrato che molti processi cellulari, come respirazione aerobica, sono arricchiti nel set di geni regolati da ossigeno.
Protocol
Representative Results
Discussion
In questo studio, i livelli di mRNA per tutti i geni è stata misurata durante l’ipossia nel lievito S. cerevisiae. L’obiettivo era di analizzare i cambiamenti di espressione genica globale a causa della crescita in un ambiente controllato vicino-anossico. Sono state adottate numerose misure per garantire che il metodo qui descritto è stato attentamente controllato e riproducibile. In primo luogo, le cellule sono state esposte ad un ambiente ipossico precisamente definito: 99,999% N2 in contenuti mul…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ringraziamo l’Istituto Lewis-Sigler per Integrative Genomics Sequencing Core Facility all’Università di Princeton per consulenza tecnica e per il sequenziamento e preparazione di RNA biblioteca. Questo lavoro è stato sostenuto da sovvenzioni da Rowan University e NIH NIGMS R15GM113187 a Boy
Materials
| Enclosed dry incubator | Thermo Scientific | MaxQ 4000 | Set at 30°C. Modify the door to allow entry of one Tygon tube. Alternatively, use the New Brunswick G25 incubator, which contains a tube port. Do not use an open-air water shaker, as condensation will collect in the tubes between flasks, possibly cross-contaminating cultures. |
| Micro-analysis Filter Holder | Millipore | XX1002530 | 25mm diameter, stainless steel support, no. 5 perforated silicone stopper mounts in standard 125mL filtering flask |
| Strong vacuum | Edwards | E-LAB 2 | The “house” vacuum may be too weak. Alternatively, use an electric-power portable vacuum pump like the one listed here. |
| 1000-mL flask | To act as vacuum trap. | ||
| ~2-foot lengths of Heavy Wall Vacuum Tubing, inner diameter 3/8 in, outer diameter 7/8 in | Tygon | 38TT | Two pieces: the first connects vacuum to trap, and the second connects trap to filter system. |
| High-pressure N2 gas tank | 99.999% purity, >1000psi, with a regulator and gas flow controller | ||
| Autoclaved 500mL flask | Opening covered with aluminum foil. One for each yeast strain. | ||
| Autoclaved 250mL flasks | Openings covered with aluminum foil. One for each time point plus two for water traps. | ||
| Flask stoppers (size 6, two holes with 5mm diameter) | Sterilized with 70% ethanol. One for each flask. | ||
| Glass tubing, length 9 cm or 17 cm, inner diameter 2 mm, outer diameter 5 mm | Sterilized with 70% ethanol. Two tubes for each flask. Place into the holes of each stopper. See Figure 1 for placement of 9- vs 17- cm tubes. | ||
| ~25-cm lengths of plastic tubing, inner diameter 5 mm | Tygon | E-3603 | One piece for each flask. Sterilized with 70% ethanol. |
| Sterile filter discs | Millipore | HAWP02500 | 25mm diameter, 0.45 µm pore size, one for each time point |
| Sterile dH2O (~100mL) | |||
| 1-mL cuvettes | For measuring OD600 (i.e., cell concentration) | ||
| 50-mL sterile centrifuge tubes | One for each time point | ||
| Clean and sterile tweezers | |||
| liquid nitrogen | For freezing cells | ||
| acid-washed beads | Sigma | G8772 | Keep at 4°C for lysing cells |
| Qiagen RNeasy Mini Kit | Qiagen | 74104 | For RNA column purification |
| Qiagen RLT buffer | Prepare by adding 10µL of β-Mercaptoethanol per 1mL of RLT buffer, keep at 4C. | ||
| 2-mL collection tubes | Qiagen | included in the Qiagen Rneasy Mini Kit | |
| Buffer RPE | Qiagen | included in the Qiagen Rneasy Mini Kit | |
| Buffer RW1 | Qiagen | included in the Qiagen Rneasy Mini Kit | |
| DNase I stock and working solutions | Qiagen | 79254 | The DNase I enzyme comes as lyophilized powder in a glass vial. Using a sterile needle and syringe, inject 550µL of RNase-free water (provided in Qiagen kit) into the vial. Mix by gently inverting the bottle. To avoid denaturing the enzyme, do not vortex. Using a pipet, remove this stock solution from the vial and store in freezer (-20°C) in single-use aliquots (80µL each). The stock solution should not be thawed and refrozen. |
| Buffer RDD | Qiagen | included in the Qiagen DNase Kit | |
| Ice cold 2-mL screw-cap tubes | For lysing cells during RNA extraction | ||
| bead mill homogenizer | Biospec Mini-Beadbeater-24 | 112011 | Keep in cold room |
| Bacto Peptone | BD | DF0118 | for liquid YPD media |
| Bacto Yeast Extract | BD | DF0886 | for liquid YPD media |
| glucose | Fisher | D16 | for liquid YPD media |
| Qubit assay tubes | Thermo Fisher | Q32856 | for measuring nucleic acid concentration |
| Quant-iTTM dsDNA BR Assay Kit | Thermo Fisher | Q32853 | for measuring nucleic acid concentration |
| Quant-iTTM RNA Assay Kit | Thermo Fisher | Q32855 | for measuring nucleic acid concentration |
| Qubit Fluorometer | Thermo Fisher | Q33216 | for measuring nucleic acid concentration |
| Commercial electrophoresis system | Agilent | Bioanalyzer 2100 | for measuring nucleic acid quality |
| Next-generation sequencer | Illumina | HiSeq 2500 | for sequencing libraries |
| automated liquid handling system | Wafergen | Apollo 324 | for creating sequencing libraries |
| PrepX PolyA mRNA Isolation Kit | Wafergen | 400047 | for isolating mRNA from total RNA |
| PrepX RNA SEQ for Illumina Library Kit | Wafergen | 400039 | for creating strand-specific sequencing libraries from total RNA |
| Barcode Splitter | https://toolshed.g2.bx.psu.edu/repository?repository_id=7119c4f7a89efa57&changeset_revision=e7b7cdc1834d | ||
| Samtools, which includes the gzip command | http://www.htslib.org/download/ | ||
| Trimmomatic | http://www.usadellab.org/cms/?page=trimmomatic | ||
| Bowtie2 (installed before TopHat) | http://bowtie-bio.sourceforge.net/bowtie2/index.shtml | ||
| TopHat | https://ccb.jhu.edu/software/tophat/index.shtml | ||
| HTSeq | http://www-huber.embl.de/HTSeq/doc/overview.html | ||
| R (installed before R Studio) | https://cran.rstudio.com | ||
| R Studio (free version) | https://www.rstudio.com/products/rstudio/download/ |
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