Medição de níveis de mRNA ao longo do tempo durante a levedura s. cerevisiae hipóxica resposta

Summary

Aqui, apresentamos um protocolo utilizando RNA-seq para monitorar os níveis do mRNA ao longo do tempo durante a hipoxia resposta das células de S. cerevisiae . Esse método pode ser adaptado para analisar a expressão gênica durante qualquer resposta celular.

Abstract

Complexas mudanças na expressão gênica tipicamente mediam uma grande parcela de uma resposta celular. Cada gene pode alterar a expressão com cinética original como o gene é regulamentado pelo sincronismo particular de um dos muitos estímulos, sinalização de percursos ou efeitos secundários. A fim de capturar o gene todo resposta de expressão à hipoxia em levedura S. cerevisiae, análise de RNA-seq foi usada para monitorizar os níveis de mRNA de genes todos em horários específicos, após a exposição à hipoxia. Hipóxia foi estabelecida pelo crescimento de células de gás de₂ ~ 100% N. Importante, ao contrário de outros estudos hipóxicos, ergosterol e ácidos graxos insaturados não foram adicionados para a mídia porque estes metabólitos afetam a expressão genética. Pontos de tempo foram escolhidos na faixa de 0 – 4 h após hipoxia porque esse período captura as grandes mudanças na expressão gênica. Em cada ponto de tempo, mid log hipóxicos células foram rapidamente filtrada e congelado, limitar a exposição ao₂ e concomitante as mudanças na expressão gênica. O RNA total foi extraído de células e usado para enriquecer para mRNA, que depois foi convertido em cDNA. A partir deste cDNA, multiplex bibliotecas foram criadas e oito ou mais amostras foram sequenciadas em uma pista de um sequenciador de última geração. Um pipeline pós-sequenciamento é descrito, que inclui o aparamento de base de qualidade, ler o mapeamento e determinar o número de leituras por gene. DESeq2 dentro do ambiente de estatística R foi usado para identificar genes que alteram significativamente em qualquer um dos pontos de tempo hipóxica. A análise de três réplicas biológicas revelou grande reprodutibilidade, genes da cinética diferente e um grande número de esperado O₂-regulado genes. Esses métodos podem ser usados para estudar como as células de vários organismos respondem à hipoxia ao longo do tempo e adaptados para estudar a expressão gênica durante outras respostas celulares.

Introduction

Muitos organismos respondem a hipoxia, ou O baixo₂, alterando a expressão de gene a ^1,2,3. Esta resposta ajuda a lidar com a falta de um substrato fundamental para a respiração aeróbia e para diversas reações biossintéticas, mas também com uma mudança de estado redox ⁴células. Vários estudos de microarray, realizados em S. cerevisiae mostram que os níveis de RNAm de centenas de genes mudam em resposta a hipóxia ^{5,6,7,8,9 , 10 , 11 , 12}. recentemente, RNA-seq era usado para caracterizar as mudanças de expressão do gene ao longo do tempo durante a hipóxia ¹³. Aqui, os detalhes experimentais são apresentados e discutidos.

Hipóxia pode ser conseguida de várias maneiras, cada uma produzindo um nível diferente de O₂. Aqui, hipóxia foi estabelecida por continuamente fluindo ultra-alta-pureza N₂ balões, que reduz a [O₂] imediatamente dissolvido com cinética reprodutíveis ¹⁰. É possível que há algumas₂ moléculas O presentes que contribuem para a expressão de gene e metabolismo, mas este ambiente é considerado muito perto anaeróbica. Na ausência de O₂, as células de levedura não heme biossintetize, ergosterol e ácidos graxos insaturados ^4,12,14. Assim, estudos anteriores incluíram estes metabólitos quando crescer o fermento sem oxigênio ^5,10,15. No entanto, muitas respostas hipóxicos são mediadas por esgotamento destes metabolitos e assim reabastecer os inverte o gene hipóxica expressão respostas ^12,16. Para imitar a hipóxia natural, estes metabólitos não foram adicionados aos meios de comunicação. No pouco tempo que as células foram expostas a hipóxia sem a presença desses metabólitos essenciais, não havia nenhum aumento perceptível na morte celular (dados não mostrados) nem uma resposta de estresse prolongado ¹³.

A resposta também é dependente da cepa e o seu genótipo. Especialmente importantes são os alelos dos reguladores conhecidos do hipóxica respostas ². O fundo de tensão S288C é altamente desejado para que os resultados podem ser comparados a outros estudos genômicos realizados com esta estirpe. No entanto, o S288C contém um alelo de perda-de-função parcial do HAP1 gene ¹⁷, um regulador transcricional crítico para a resposta a hipoxia. Este alelo foi reparado em S288C utilizando uma sua cópia do Σ1278b Coe fundo ¹¹.

Expressão gênica é altamente dependente do ambiente celular. Assim, ao realizar a análise do mRNA de todo o genoma, é importante manter um ambiente de constante ao mesmo tempo variando de outro parâmetro como tempo, estímulo ou genótipo. Para alcançar resultados altamente reprodutíveis, considere estas três práticas para o estudo e todas suas réplicas biológicas ou técnicas. Em primeiro lugar, a mesma experimenter(s) deve realizar o estudo, desde que as práticas técnicas podem variar entre experimentadores. Em segundo lugar, o mesmo lote dos ingredientes deve ser usado nos meios de comunicação de crescimento como cada lote tem uma composição ligeiramente diferente que pode afetar a expressão do gene. Em terceiro lugar, para minimizar os efeitos do ciclo celular, cada ponto de tempo deve consistir de células assíncronas na fase log de média de crescimento (1-2 x 10⁷ células/mL).

Quando caracterizando uma resposta complexa como a expressão de gene resposta à hipoxia, um curso de tempo é vantajoso para determinar a cinética de diversos eventos. Pontos de tempo específico devem ser escolhidos que irá capturar as principais alterações da resposta. Neste estudo, foram observados pontos de tempo entre 0 e 4 h, porque experiências passadas revelaram generalizadas alterações na expressão gênica durante este período ¹³.

Para medir a expressão gênica global, RNA-seq foi usado ^18,19. Este método usa o sequenciamento de última geração para determinar a abundância relativa de transcrição do gene cada. Em comparação com análise de microarray de DNA, RNA-seq apresenta maior sensibilidade (para detectar menos abundantes transcrições), uma maior gama dinâmica (para medir alterações maiores de dobra) e reprodutibilidade superior (para seguir com precisão a expressão gênica ao longo do tempo). Normalmente, o RNA celular mais é RNA ribossomal, que muitos métodos têm sido desenvolvidos para enriquecer específicas do RNA espécie ²⁰. Aqui, grânulos de poli-T foram utilizados para purificar A poli-contendo transcrições de mRNA, embora os diversos comercialmente – disponíveis kits de depleção de rRNA podem também ser eficazes no enriquecimento do mRNA.

Caracterizou-se aqui, a resposta de expressão do gene de S. cerevisiae à hipoxia. As células foram expostas à hipoxia e então amostradas em oito pontos de tempo (0, 5, 10, 30, 60, 120, 180 e 240 min). Para confirmar a reprodutibilidade e identificar estatisticamente alteradas transcrições, realizaram-se três repetições biológicas. RNA foi extraído por ruptura mecânica e purificação da coluna e processado para análise de RNA-seq. Pós-sequenciamento pipeline é descrito e scripts de programação são fornecidos que permitem a replicação exata das análises realizadas. Especificamente, Trimmomatic ²¹, TopHat2 ²², HTseq ²³, o ambiente estatístico R ²⁴e o pacote de DESeq2 ²⁵ foram usados para processar os dados de RNA-seq e identificar 607 genes que mudam significativamente durante hipóxia. Análise de componentes principais (PCA) e expressão gênica das repetições indicaram a reprodutibilidade da técnica. Clustering e heatmaps revelou cinética de expressão abrangente, enquanto a análise do gene ontology (GO) mostrou que muitos processos celulares, como a respiração aeróbia, são enriquecidos no conjunto de genes regulados de oxigênio.

Protocol

1. indução de hipóxia Um dia ou mais antes do curso do tempo de hipoxia: preparar a incubadora, célula de filtragem sistema, vácuo, tanque de gasolina, balões, rolhas, tubos de vidro e tubos, como a Tabela de materiais. Coloque o tanque de2 N, incubadora, sistema de vácuo e filtragem nas proximidades, para permitir o processamento rápido das células. Prepare a mídia YPD líquida estéril (1% de extracto de levedura, peptona de 2%, 2% de glicose) misturan…

Representative Results

O curso de tempo de hipóxia e RNA-seq análise foram realizadas independentemente de três vezes. Para examinar a reprodutibilidade de as três repetições, dados da expressão do gene para todos os genes foi analisados usando análise de componente Principal (PCA). A Figura 2 mostra como as amostras mudam durante os dois primeiros componentes principais, que juntos representam 58,9% da variabilidade. Esta análise indicou que cada curso do tempo exibe alte…

Discussion

Neste estudo, os níveis de RNAm para todos os genes foi medido durante hipóxia em levedura S. cerevisiae. O objetivo foi analisar as mudanças de expressão de gene como global devido ao crescimento em um ambiente controlado de perto-anóxica. Várias medidas foram tomadas para garantir que o método descrito aqui foi cuidadosamente controlada e reprodutível. Primeiro, as células foram expostas a um ambiente hipóxico precisamente definido: 99,999% N₂ em mídia rica (YPD). Outros estudos de hipóx…

Materials

Enclosed dry incubator	Thermo Scientific	MaxQ 4000	Set at 30°C. Modify the door to allow entry of one Tygon tube. Alternatively, use the New Brunswick G25 incubator, which contains a tube port. Do not use an open-air water shaker, as condensation will collect in the tubes between flasks, possibly cross-contaminating cultures.
Micro-analysis Filter Holder	Millipore	XX1002530	25mm diameter, stainless steel support, no. 5 perforated silicone stopper mounts in standard 125mL filtering flask
Strong vacuum	Edwards	E-LAB 2	The “house” vacuum may be too weak. Alternatively, use an electric-power portable vacuum pump like the one listed here.
1000-mL flask			To act as vacuum trap.
~2-foot lengths of Heavy Wall Vacuum Tubing, inner diameter 3/8 in, outer diameter 7/8 in	Tygon	38TT	Two pieces: the first connects vacuum to trap, and the second connects trap to filter system.
High-pressure N2 gas tank			99.999% purity, >1000psi, with a regulator and gas flow controller
Autoclaved 500mL flask			Opening covered with aluminum foil. One for each yeast strain.
Autoclaved 250mL flasks			Openings covered with aluminum foil. One for each time point plus two for water traps.
Flask stoppers (size 6, two holes with 5mm diameter)			Sterilized with 70% ethanol. One for each flask.
Glass tubing, length 9 cm or 17 cm, inner diameter 2 mm, outer diameter 5 mm			Sterilized with 70% ethanol. Two tubes for each flask. Place into the holes of each stopper. See Figure 1 for placement of 9- vs 17- cm tubes.
~25-cm lengths of plastic tubing, inner diameter 5 mm	Tygon	E-3603	One piece for each flask. Sterilized with 70% ethanol.
Sterile filter discs	Millipore	HAWP02500	25mm diameter, 0.45 µm pore size, one for each time point
Sterile dH2O (~100mL)
1-mL cuvettes			For measuring OD600 (i.e., cell concentration)
50-mL sterile centrifuge tubes			One for each time point
Clean and sterile tweezers
liquid nitrogen			For freezing cells
acid-washed beads	Sigma	G8772	Keep at 4°C for lysing cells
Qiagen RNeasy Mini Kit	Qiagen	74104	For RNA column purification
Qiagen RLT buffer			Prepare by adding 10µL of β-Mercaptoethanol per 1mL of RLT buffer, keep at 4C.
2-mL collection tubes	Qiagen		included in the Qiagen Rneasy Mini Kit
Buffer RPE	Qiagen		included in the Qiagen Rneasy Mini Kit
Buffer RW1	Qiagen		included in the Qiagen Rneasy Mini Kit
DNase I stock and working solutions	Qiagen	79254	The DNase I enzyme comes as lyophilized powder in a glass vial. Using a sterile needle and syringe, inject 550µL of RNase-free water (provided in Qiagen kit) into the vial. Mix by gently inverting the bottle. To avoid denaturing the enzyme, do not vortex. Using a pipet, remove this stock solution from the vial and store in freezer (-20°C) in single-use aliquots (80µL each). The stock solution should not be thawed and refrozen.
Buffer RDD	Qiagen		included in the Qiagen DNase Kit
Ice cold 2-mL screw-cap tubes			For lysing cells during RNA extraction
bead mill homogenizer	Biospec Mini-Beadbeater-24	112011	Keep in cold room
Bacto Peptone	BD	DF0118	for liquid YPD media
Bacto Yeast Extract	BD	DF0886	for liquid YPD media
glucose	Fisher	D16	for liquid YPD media
Qubit assay tubes	Thermo Fisher	Q32856	for measuring nucleic acid concentration
Quant-iTTM dsDNA BR Assay Kit	Thermo Fisher	Q32853	for measuring nucleic acid concentration
Quant-iTTM RNA Assay Kit	Thermo Fisher	Q32855	for measuring nucleic acid concentration
Qubit Fluorometer	Thermo Fisher	Q33216	for measuring nucleic acid concentration
Commercial electrophoresis system	Agilent	Bioanalyzer 2100	for measuring nucleic acid quality
Next-generation sequencer	Illumina	HiSeq 2500	for sequencing libraries
automated liquid handling system	Wafergen	Apollo 324	for creating sequencing libraries
PrepX PolyA mRNA Isolation Kit	Wafergen	400047	for isolating mRNA from total RNA
PrepX RNA SEQ for Illumina Library Kit	Wafergen	400039	for creating strand-specific sequencing libraries from total RNA
Barcode Splitter			https://toolshed.g2.bx.psu.edu/repository?repository_id=7119c4f7a89efa57&changeset_revision=e7b7cdc1834d
Samtools, which includes the gzip command			http://www.htslib.org/download/
Trimmomatic			http://www.usadellab.org/cms/?page=trimmomatic
Bowtie2 (installed before TopHat)			http://bowtie-bio.sourceforge.net/bowtie2/index.shtml
TopHat			https://ccb.jhu.edu/software/tophat/index.shtml
HTSeq			http://www-huber.embl.de/HTSeq/doc/overview.html
R (installed before R Studio)			https://cran.rstudio.com
R Studio (free version)			https://www.rstudio.com/products/rstudio/download/