Fluorescence de cellule unique résolution vivre Imaging of Drosophila horloges circadiennes dans cerveau larvaire Culture
Summary
Le but du présent protocole est d’établir la culture ex vivo Drosophila cerveau larvaire optimisée pour surveiller des rythmes circadiens moléculaires avec imagerie Time-lapse à long terme de fluorescence. On discute également l’application de cette méthode pour les essais pharmacologiques.
Abstract
Le circuit de pacemaker circadien orchestre rythmiques sorties comportementales et physiologiques, en coordination avec les signaux environnementaux, tels que les cycles jour/nuit. L’horloge moléculaire au sein de chaque neurone stimulateur génère les rythmes circadiens dans l’expression des gènes, qui sous-tendent les fonctions neuronales rythmiques essentielles au fonctionnement du circuit. Étude des propriétés des oscillateurs moléculaires individuelles dans les différentes sous-classes de neurones pacemaker et leur interaction avec la signalisation neuronale permet de mieux comprendre le circuit de pacemaker circadien. Ici, nous présentons une approche de Time-lapse microscopie fluorescente mis au point pour surveiller l’horloge moléculaire dans les neurones d’horloge de cultivées cerveau larve de drosophile . Cette méthode permet l’enregistrement de plusieurs jour des rythmes de reporters circadiennes fluorescents génétiquement encodées à cellule unique résolution. Cette configuration peut être associée à des manipulations pharmacologiques pour analyser attentivement la réponse en temps réel de l’horloge moléculaire de composés. Au-delà des rythmes circadiens, cette méthode polyvalente en combinaison avec les techniques génétiques puissantes Drosophila offre la possibilité d’étudier différents processus neurones ou moléculaires dans le tissu cérébral direct.
Introduction
Horloges circadiennes aident les organismes à s’adapter aux changements environnementaux périodiques générées par la rotation de 24h de la terre. Les boucles de rétroaction transcriptionnel traductionnel contrefil communément sous-tendent la machinerie moléculaire des horloges circadiennes ensemble espèce1. Le circuit de pacemaker circadien composé horloge contenant des neurones intègre time-of-day information véhiculée par les signaux environnementaux, tels que la lumière/obscurité (LD) et les cycles de température, d’orchestrer les rythmes d’une pléthore de quotidien physiologique et les processus comportementaux2,3. La coordination des rythmes moléculaires avec neuronales entrées et sorties est cruciale pour le fonctionnement du circuit circadien, mais reste que partiellement compris.
Chez la drosophile, au cœur de l’horloge moléculaire, l’hétérodimère/CYCLE d’horloge (CLK/CYC) active la transcription de la période (par) et intemporels (tim). PER et TIM forment un complexe et entrer dans le noyau, où ils inhibent l’activité transcriptionnelle de CLK/CYC et, par conséquent, leur propre transcription. Règlement post-transcriptionnelle et post-traductionnelles entraînent des retards entre CLK/CYC-mediated transcription et de la répression par p. / TIM, assurer la génération de circa oscillations moléculaires 24 h1,3,4 . Environ 150 neurones contenant ces horloges moléculaires forme un circuit de contrôle circadien comportement d’adulte vole5. Un beaucoup plus simple et entièrement fonctionnelles circadiens circuit composé de 3 groupes de neurones de l’horloge – 5 neurones latérale ventrale (LNvs ; 4 LNvs PDF-positif et un négatif PDF LNv, voir ci-dessous), 2 dorsales neurone 1 s (DN1s) et 2 dorsales neurone 2 s (DN2s) – est présent dans les larves cerveau6,7.
Le circuit circadien larvaire simple offre un excellent modèle pour étudier les interactions entre la communication inter neuronale et l’horloge moléculaire. À l’aide de notre reporter fluorescent nouvellement mis au point par-TDT, qui imite les niveaux de protéine et sa localisation subcellulaire, nous avons cherché à caractériser la dynamique de la mécanique moléculaire en sous-groupes de neurone horloge différentes dans le circuit circadien larvaire 8. en outre, connaissant le rôle essentiel du facteur de dispersion de pigment neuropeptide (PDF) produit par 4 LNvs dans la régulation des rythmes circadiens au niveau neuronal9,10,11, nous avons voulu examiner le direct effet de PDF sur les horloges moléculaires. À cette fin, nous avons développé une méthode pour contrôler l’expression des gènes circadiens rythmes dans cerveau larvaire explant sur plusieurs jours en Time-lapse microscopie confocale. Le protocole a été également adapté pour les essais pharmacologiques tester l’effet de PDF ou d’autres composés sur le niveau de p.-TDT. Ainsi, l’adaptation se compose de vulgariser la culture d’explants de cerveau à la demande de drogue, d’augmenter la résolution temporelle et d’imagerie pour une durée plus courte.
Ex vivo culture de Drosophila cerveau des différentes étapes du développement ont été établies auparavant12,13,14,15,16,17 ,,18. Considérant que ces protocoles ont été utilisés pour l’imagerie des différents phénomènes biologiques, certains d’entre eux ne sont pas compatibles avec la formation image à résolution unicellulaire ou ne supportent pas la culture pendant plus de quelques heures. Des méthodes alternatives pour effectuer une imagerie live à long terme des neurones circadiennes chez la drosophile incluent l’imagerie bioluminescence des rythmes moléculaires19,20,21 et imagerie de fluorescence de indicateur de calcium avec nappe de lumière microscopie22,23. Bien que l’imagerie de bioluminescence peut atteindre une résolution temporelle plus élevée et la microscopie de nappe de lumière peut être adaptable pour l’imagerie in vivo , ils sont limités à la résolution spatiale et exigent des systèmes spécialisés de microscope.
La méthode décrite ici est adaptée pour visualiser les signaux fluorescents dans la culture de cerveau entier à cellule unique résolution sur plusieurs jours. Cette méthode facile et polyvalente pourrait être adaptée à cervelle de mouche adulte image cultivée et d’expériences pharmacologiques d’étudier de nombreux problèmes différents en neurobiologie de la drosophile .
Protocol
Representative Results
Discussion
Ici, nous avons décrit la méthode pour à long terme fluorecence Time-lapse d’élevage larvaire cerveaux. Le succès de ce type d’expériences dépend de plusieurs facteurs, tels que la santé de la culture, procédé d’immobilisation de l’explant de cerveau, l’intensité de la fluorescence et la ratio signal-bruit de la journaliste, temporelle et la résolution spatiale, et accessibilité de l’explant. Ces facteurs peuvent s’exclure mutuellement. Par exemple, augmentation de fréquence de Time-lapse affe…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Nous remercions Michael Rosbash son mentorat et soutien durant la phase initiale du développement de cette méthode. Ce travail a été financé par le programme JST PRESTO, de la Swiss National Science Foundation (31003A_149893 et 31003A_169548), l’European Research Council (ERC-StG-311194), la Fondation Novartis pour la recherche médicale-biomédicale (13A39) et l’Université de Genève .
Materials
| KH2PO4 | Sigma-Aldrich | P5655 | I am not sure they are exactly the same ones we have in the lab. I chose "suitable for insect cell culture" whenever available |
| CaCl2 | Sigma-Aldrich | C7902 | |
| MgSO4.7H2O | Sigma-Aldrich | 230391 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S5886 | |
| NaHCO3 | Sigma-Aldrich | S5761 | |
| D-(+) Glucose | Sigma-Aldrich | G7021 | |
| Yeast extract | Sigma-Aldrich | Y1000 | |
| Insulin | Sigma-Aldrich | I0516-5ML | |
| Penicillin-Streptomycin | Sigma-Aldrich | P4333 | |
| BIS-TRIS | Sigma-Aldrich | B4429 | |
| L-(−)-Malic acid | Sigma-Aldrich | M7397 | |
| D-(+)-Trehalose dihydrate | Sigma-Aldrich | T0167 | |
| Succinic acid | Sigma-Aldrich | S9512 | |
| Fumaric acid | Sigma-Aldrich | F8509 | |
| α-Ketoglutaric acid | Sigma-Aldrich | K1128 | |
| Non-heat-inactivated, Foetal Calf Serum (FCS) Mycoplasma and Virus screened | BioConcept Ltd. Amimed | 2-01F30-I | |
| HEPES-KOH, pH 7.4 | E&K Scientific Products | EK-654011 | |
| KCl | Sigma-Aldrich | P5405 | |
| NaH2PO4 | Sigma-Aldrich | S5011 | |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | S7903 | |
| Fibrinogen from bovine plasma | Calbiochem (Merck) | 341573-1GM | CAUTION: Harmful by inhalation, in contact with skin and if swallowed. Manipulate under laminar flow |
| Thrombin from bovine plasma | Sigma-Aldrich | T9549 | CAUTION: Health Hazard, use gloves |
| PDF, NH2-NSELINSLLSLPKNMNDA-OH | Chi Scientific | custom made | |
| Vaccum grease | Sigma-Aldrich | 18405 | |
| 35 mm Dish, No. 1.5 Coverslip, 20 mm Glass Diameter, Uncoated | MatTek | P35G-1.5-20-C | |
| Corning Falcon Easy-Grip Tissue Culture Dishes | fisherscientific | 08-772A | |
| Sterile 500 mL Steritop-GP 33 mm threaded bottle top filter, 0.22 μm | Millipore | SCGPS05RE | |
| Polytetrafluoroethylene (PTFE) film | Dupont | 200A Teflon FEP Film | |
| Millex-HV Syringe Filter Unit, 0.45 µm, PVDF, 33 mm, gamma sterilized | Millipore | SLHV033RS | |
| Millex-GV Syringe Filter Unit, 0.22 µm, PVDF, 33 mm, gamma sterilized | Millipore | SLGV033RS | |
| Three-well glass dissection dish | Any company | ||
| Fine forceps, size 5, Dumont | Fine Science Tools | 11254-20 | |
| Tandem scanner inverted TCS SP5 confocal microscope, with resonant scanner and HyD photo-multiplier detectors | Leica microsystem CMS GmbH | ||
| Temperature control chamber | Life Imaging Services | The CUBE & BOX temperature control system, custom designed | |
| Stage-top humidity controller | Life Imaging Services | custom made | |
| Water Immersion Micro Dispenser: dispenser, extended micro-pump MP6 series and Autoimmersion Objective Controller software | Leica microsystem CMS GmbH | ||
| SUM-stack creation and 3D correction drift plugin | ImageJ software | ||
| 10x iterative deconvolution | AutoQuant and Imaris software |
Referenzen
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