Einzellige Auflösung Fluoreszenz Imaging von Drosophila zirkadiane Uhren in Larven Gehirn Kultur Leben
Summary
Das Ziel dieses Protokolls ist, ex Vivo Drosophila Larven Gehirn Kultur so optimiert, dass circadiane molekulare Rhythmen mit langfristigen Zeitraffer Fluoreszenz-Bildgebung überwachen zu etablieren. Die Anwendung dieser Methode auf pharmakologische Tests wird auch diskutiert.
Abstract
Die zirkadianen Schrittmacher-Schaltung orchestriert rhythmische Verhaltens- und physiologischen Ausgänge mit ökologischen Hinweise, wie Tag/Nacht-Zyklen abgestimmt. Die molekulare Uhr innerhalb jedes Neuron Herzschrittmacher erzeugt zirkadianen Rhythmen in der Genexpression, die die rhythmischen neuronalen Funktionen wesentlich für den Betrieb der Schaltung zugrunde liegen. Untersuchung der Eigenschaften der einzelnen molekulare Oszillatoren in verschiedenen Unterklassen der Herzschrittmacher Neuronen und deren Zusammenspiel mit neuronalen Signal ergibt ein besseres Verständnis der zirkadianen Schrittmacher-Schaltung. Hier präsentieren wir Ihnen einen Zeitraffer-Fluoreszenz-Mikroskopie-Ansatz entwickelt, um die molekularen Uhrwerk in Uhr Neuronen des kultivierten Drosophila Larven Gehirn zu überwachen. Diese Methode ermöglicht die mehrtägige Aufzeichnung von den Rhythmen der genetisch codierten fluoreszierende circadiane Reporter bei einzelligen Auflösung. Dieses Setup ist kombinierbar mit pharmakologische Manipulationen zu Echtzeit-Reaktion der molekularen Uhr zu verschiedenen Verbindungen genau analysieren. Über zirkadianen Rhythmen bietet diese multifunktionale Methode in Kombination mit leistungsstarken Drosophila genetische Techniken die Möglichkeit verschiedene neuronale oder molekulare Prozesse in live Hirngewebe zu studieren.
Introduction
Zirkadiane Uhren helfen Organismen zur Anpassung an die periodischen Veränderungen der Umwelt durch die 24-Stunden-Rotation der Erde erzeugt. Interlock transkriptionelle translationale Rückkopplungsschleifen unterliegen häufig der molekulare Maschinerie der zirkadianen Taktgeber über Arten1. Die zirkadianen Schrittmacher-Schaltung, bestehend aus Uhr-haltigen Neuronen integriert-Uhrzeit-Informationen vermittelt durch die Umwelt-Signale, wie hell/dunkel (LD) und Temperaturzyklen, die Rhythmen von einer Vielzahl von täglich zu orchestrieren physiologischen und Verhaltensstörungen Prozesse2,3. Die Koordinierung der molekularen Rhythmen mit neuronalen ein- und Ausgängen ist von entscheidender Bedeutung für den Betrieb der circadianen Schaltung aber bleibt nur teilweise verstanden.
Das Herzstück der molekularen Uhr aktiviert TAKTZYKLUS (CLK/CYC) Heterodimer in Drosophila, die Transkription von Zeit (pro) und zeitlos (Tim). V. und TIM bilden einen Komplex und geben Sie den Zellkern, wo sie transkriptionelle Aktivität der CLK/CYC und somit ihren eigenen Transkription hemmen. Posttranskriptionale und post-translationalen Vorschriften verursachen Verzögerungen zwischen CLK/CYC-vermittelten Transkription und Unterdrückung durch v. / TIM, Sicherstellung der Generation von ca. 24 h molekulare Schwingungen1,3,4 . Etwa 150 Neuronen, die diese molekulare Uhren-Formular enthält fliegt eine Schaltung zur Kontrolle circadiane Verhalten der Erwachsenen5. Eine viel einfachere und dennoch voll funktionsfähige circadiane Schaltung bestehend aus 3 Gruppen von Neuronen Uhr – 5 ventralen lateralen Neuronen (LNvs; 4 PDF-Positive LNvs und ein PDF-Negative LNv, siehe unten), 2 dorsalen Neuron 1 s (DN1s) und 2 dorsalen Neuron 2 s (DN2s) – ist in der Larven Gehirn6,7.
Die einfache Larven circadiane Schaltung bietet ein hervorragendes Modell zur Untersuchung der Wechselwirkungen zwischen Inter neuronale Kommunikation und das molekulare Uhrwerk. Mit unserer neu entwickelten fluoreszierende Reporter pro-TDT, die das Niveau der pro Protein und seine subzelluläre Lage imitiert, haben wir versucht, die Dynamik des molekularen Uhrwerks in verschiedenen Uhr Neuron Untergruppen in der Larven circadiane Schaltung charakterisieren 8. Darüber hinaus wollten wir wissen, die Schlüsselrolle von Neuropeptid Pigment dispersing Factor (PDF) produziert von 4 LNvs bei der Regulierung der zirkadianen Rhythmen auf der neuronalen Ebene9,10,11, untersuchen Sie den direkten Wirkung von PDF auf molekularen Uhren. Zu diesem Zweck haben wir eine Methode, um die circadiane Genexpression überwachen Rhythmen im Larvenstadium Gehirn über mehrere Tage durch Time-Lapse confocal Mikroskopie explant entwickelt. Das Protokoll wurde auch für pharmakologische Tests, testen Sie die Wirkung von PDF- oder andere Verbindungen auf das Niveau der pro-TDT angepasst. Somit besteht die Anpassung der Zugänglichmachung der Gehirn Explant Kultur zu Drug Application, Zeitauflösung und imaging für eine kürzere Dauer.
Ex-Vivo -Kultur von Drosophila Gehirne von unterschiedlichen Entwicklungsstadien wurden vorher festgelegten12,13,14,15,16,17 ,18. Während diese Protokolle für verschiedene biologische Phänomene-Bildgebung verwendet wurden, einige von ihnen sind nicht kompatibel mit Bildgebung bei einzelligen Auflösung oder unterstützen die Kultur nicht mehr als ein paar Stunden. Alternative Methoden, um langfristige live Darstellung der circadianen Neuronen in Drosophila durchzuführen sind Biolumineszenz Bildgebung von molekularen Rhythmen19,20,21 und Fluoreszenz-Bildgebung des Kalzium-Anzeige mit Licht Merkblatt Mikroskopie22,23. Obwohl Biolumineszenz Bildgebung höheren zeitlichen Auflösung erreichen und Lichtblattmikroskopie für in-Vivo Bildgebung anpassungsfähig sein kann, sie sind begrenzt auf die räumliche Auflösung und erfordern spezialisierte Mikroskopsystemen.
Die hier beschriebene Methode ist zugeschnitten auf um fluoreszierende Signale in der Gesamt-Hirn Kultur bei einzelligen Auflösung über mehrere Tage zu visualisieren. Diese einfache und vielseitige Methode könnte Bild kultiviert Erwachsenen fliegen Köpfe und für pharmakologische Experimente zur Untersuchung viele verschiedene Probleme in Drosophila Neurobiologie angepasst werden.
Protocol
Representative Results
Discussion
Hier haben wir die Methode zur langfristigen Zeitraffer Fluoreszenzmikroskopie kultivierten Larven Gehirne beschrieben. Der Erfolg dieser Art von Experimenten hängt von mehreren Faktoren ab, wie die Gesundheit der Kultur, Methode zur Immobilisierung des Gehirns Explant, Fluoreszenzintensität und Signal-Rausch-Verhältnis der Reporter, zeitliche und räumliche Auflösung und Zugänglichkeit zu den Explant. Diese Faktoren können sich gegenseitig ausschließen. Zum Beispiel Zeitraffer Häufigkeit beeinflusst die Gesundhe…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wir danken Michael Rosbash für seine Betreuung und Unterstützung während der Anfangsphase der Entwicklung dieser Methode. Diese Arbeit wurde vom JST PRESTO-Programm des Schweizer Nationalfonds (31003A_149893 und 31003A_169548), der Europäische Forschungsrat (ERC-StG-311194), Novartis Stiftung für medizinisch-biomedizinische Forschung (13A39) und der Universität Genf finanziert. .
Materials
| KH2PO4 | Sigma-Aldrich | P5655 | I am not sure they are exactly the same ones we have in the lab. I chose "suitable for insect cell culture" whenever available |
| CaCl2 | Sigma-Aldrich | C7902 | |
| MgSO4.7H2O | Sigma-Aldrich | 230391 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S5886 | |
| NaHCO3 | Sigma-Aldrich | S5761 | |
| D-(+) Glucose | Sigma-Aldrich | G7021 | |
| Yeast extract | Sigma-Aldrich | Y1000 | |
| Insulin | Sigma-Aldrich | I0516-5ML | |
| Penicillin-Streptomycin | Sigma-Aldrich | P4333 | |
| BIS-TRIS | Sigma-Aldrich | B4429 | |
| L-(−)-Malic acid | Sigma-Aldrich | M7397 | |
| D-(+)-Trehalose dihydrate | Sigma-Aldrich | T0167 | |
| Succinic acid | Sigma-Aldrich | S9512 | |
| Fumaric acid | Sigma-Aldrich | F8509 | |
| α-Ketoglutaric acid | Sigma-Aldrich | K1128 | |
| Non-heat-inactivated, Foetal Calf Serum (FCS) Mycoplasma and Virus screened | BioConcept Ltd. Amimed | 2-01F30-I | |
| HEPES-KOH, pH 7.4 | E&K Scientific Products | EK-654011 | |
| KCl | Sigma-Aldrich | P5405 | |
| NaH2PO4 | Sigma-Aldrich | S5011 | |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | S7903 | |
| Fibrinogen from bovine plasma | Calbiochem (Merck) | 341573-1GM | CAUTION: Harmful by inhalation, in contact with skin and if swallowed. Manipulate under laminar flow |
| Thrombin from bovine plasma | Sigma-Aldrich | T9549 | CAUTION: Health Hazard, use gloves |
| PDF, NH2-NSELINSLLSLPKNMNDA-OH | Chi Scientific | custom made | |
| Vaccum grease | Sigma-Aldrich | 18405 | |
| 35 mm Dish, No. 1.5 Coverslip, 20 mm Glass Diameter, Uncoated | MatTek | P35G-1.5-20-C | |
| Corning Falcon Easy-Grip Tissue Culture Dishes | fisherscientific | 08-772A | |
| Sterile 500 mL Steritop-GP 33 mm threaded bottle top filter, 0.22 μm | Millipore | SCGPS05RE | |
| Polytetrafluoroethylene (PTFE) film | Dupont | 200A Teflon FEP Film | |
| Millex-HV Syringe Filter Unit, 0.45 µm, PVDF, 33 mm, gamma sterilized | Millipore | SLHV033RS | |
| Millex-GV Syringe Filter Unit, 0.22 µm, PVDF, 33 mm, gamma sterilized | Millipore | SLGV033RS | |
| Three-well glass dissection dish | Any company | ||
| Fine forceps, size 5, Dumont | Fine Science Tools | 11254-20 | |
| Tandem scanner inverted TCS SP5 confocal microscope, with resonant scanner and HyD photo-multiplier detectors | Leica microsystem CMS GmbH | ||
| Temperature control chamber | Life Imaging Services | The CUBE & BOX temperature control system, custom designed | |
| Stage-top humidity controller | Life Imaging Services | custom made | |
| Water Immersion Micro Dispenser: dispenser, extended micro-pump MP6 series and Autoimmersion Objective Controller software | Leica microsystem CMS GmbH | ||
| SUM-stack creation and 3D correction drift plugin | ImageJ software | ||
| 10x iterative deconvolution | AutoQuant and Imaris software |
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