Cella singola risoluzione fluorescenza Live Imaging di Drosophila orologi circadiani nel cervello larvale cultura
Summary
L’obiettivo del presente protocollo è quello di stabilire ex vivo Drosophila cultura larvale cervello ottimizzato per monitorare i ritmi circadiani molecolari con formazione immagine di time-lapse fluorescenza a lungo termine. L’applicazione di questo metodo a dosaggi farmacologici inoltre è discussa.
Abstract
Il circuito di stimolatore cardiaco circadiano Orchestra ritmiche uscite comportamentali e fisiologiche, coordinate con segnali ambientali, ad esempio cicli giorno/notte. L’orologio molecolare all’interno di ogni neurone di pacemaker genera i ritmi circadiani nell’espressione genica, che sottendono le funzioni neuronali ritmiche essenziali per il funzionamento del circuito. Indagine delle proprietà di singoli oscillatori molecolare in diverse sottoclassi di neuroni pacemaker e la loro interazione con la segnalazione di un neurone produce una migliore comprensione del circuito stimolatore cardiaco circadiano. Qui, presentiamo un approccio di time-lapse microscopia fluorescente sviluppato per monitorare l’orologio molecolare in neuroni di orologio di coltura della drosofila larvale cervello. Questo metodo permette la registrazione di multi-giorno dei ritmi di reporter circadiano fluorescenti geneticamente codificato a cella singola risoluzione. Questa configurazione può essere abbinata a manipolazioni farmacologiche per analizzare da vicino risposta in tempo reale dell’orologio molecolare di vari composti. Oltre i ritmi circadiani, questo metodo multiuso in combinazione con potenti tecniche genetiche di Drosophila offre la possibilità di studiare diversi processi neuronali o molecolari in tessuto cerebrale dal vivo.
Introduction
Orologi circadiani aiutano gli organismi ad adattarsi ai cambiamenti ambientali periodici generati dalla rotazione della terra 24 h. I cicli di feedback trascrizionale traslazionale interbloccata comunemente sono alla base di macchine molecolari della orologi circadiani attraverso specie1. Il circuito di stimolatore cardiaco circadiano composto contenente orologio neuroni integra time-of-day informazioni veicolate dagli stimoli ambientali, come luce/buio (LD) e cicli di temperatura, di orchestrare i ritmi di una pletora di quotidiano fisiologico e processi comportamentali2,3. Il coordinamento dei ritmi molecolari con un neurone ingressi e uscite è di fondamentale importanza per il funzionamento del circuito circadiano ma resti solo parzialmente capiti.
In Drosophila, il nucleo dell’orologio molecolare, l’eterodimero/ciclo di CLOCK (CLK/CYC) attiva la trascrizione di periodo (a) e senza tempo (tim). TIM e PER formare un complesso ed entrare nel nucleo, dove inibiscono l’attività trascrizionale di CLK/CYC e di conseguenza la propria trascrizione. Post-trascrizionali e post-traduzionali regolamenti causano ritardi tra CLK/CYC-mediata trascrizione e repressione di PER / TIM, garantendo la generazione di circa 24-h oscillazioni molecolari1,3,4 . Circa 150 neuroni contenenti questi orologi molecolari forma un circuito per controllare il comportamento circadiano di adulto Vola5. Un molto più semplice ma completamente funzionale circadiano circuito composto da 3 gruppi di neuroni orologio – 5 neuroni laterale ventrale (LNvs; 4 PDF-positivi LNvs e un PDF-negativi LNv, vedi sotto), 2 dorsali del neurone 1s (DN1s) e 2 dorsale del neurone 2s (DN2s) – è presente nel larvale cervello6,7.
Il semplice circuito circadiano larvale offre un eccellente modello per studiare le interazioni tra la comunicazione inter-neuronale e l’orologio molecolare. Utilizzando il nostro reporter fluorescente recente sviluppato PER-TDT, che imita i livelli di PER proteina e la sua posizione subcellulare, abbiamo cercato di caratterizzare la dinamica del movimento a orologeria molecolare nei sottogruppi di neurone differenti dell’orologio nel circuito circadiano larvale 8. Inoltre, conoscendo il ruolo chiave del fattore di dispersione del pigmento di neuropeptide (PDF) prodotto da 4 LNvs nel regolare i ritmi circadiani a livello neuronale9,10,11, abbiamo voluto esaminare il diretto effetto di PDF sugli orologi molecolari. A tal fine, abbiamo sviluppato un metodo per monitorare l’espressione genica circadiana ritmi nel cervello larvale explant di più giorni mediante microscopia confocale a time-lapse. Il protocollo è stato anche adattato per i dosaggi farmacologici testare l’effetto di PDF o altri composti sul livello di PER-TDT. Così, l’adattamento è costituito da rendendo accessibile all’applicazione di droga la cultura di espianto del cervello, aumentando la risoluzione temporale e imaging per una durata più breve.
Ex vivo cultura del cervello di Drosophila di diversi stadi di sviluppo sono stati stabiliti in precedenza12,13,14,15,16,17 ,18. Considerando che questi protocolli sono stati utilizzati per l’imaging di vari fenomeni biologici, alcuni di loro non sono compatibili con formazione immagine a risoluzione di singole cellule o non supportano la cultura per più di alcune ore. Metodi alternativi per eseguire imaging dal vivo a lungo termine dei neuroni circadiani in Drosophila includono bioluminescenza imaging molecolare ritmi19,20,21 e imaging di fluorescenza indicatore di calcio con foglio leggero microscopia22,23. Anche se imaging bioluminescenza può raggiungere la più alta risoluzione temporale e microscopia foglio leggero può essere adattabile per l’imaging in vivo , essi hanno limitati la risoluzione spaziale e richiedono sistemi di microscopia specializzati.
Il metodo qui descritto è su misura per visualizzare segnali fluorescenti nella cultura intero cervello a cella singola risoluzione di più giorni. Questo metodo facile e versatile può essere adattato ai cervelli volare adulto immagine coltivata e per gli esperimenti farmacologici studiare diversi problemi in neurobiologia della drosofila .
Protocol
Representative Results
Discussion
Qui abbiamo descritto il metodo per lungo termine microscopia di fluorescenza time-lapse di cervelli larvale coltivate. Il successo di questo tipo di esperimenti dipende da molteplici fattori, come la salute della cultura, metodo per immobilizzazione del espianto del cervello, l’intensità di fluorescenza e rapporto segnale-rumore del reporter, temporale e risoluzione spaziale, e accessibilità per l’espianto. Questi fattori possono essere mutuamente esclusivi. Ad esempio, aumentando la frequenza time-lapse colpisce la s…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ringraziamo Michael Rosbash per suo tutoraggio e supporto durante la fase iniziale dello sviluppo di questo metodo. Questo lavoro è stato finanziato dal programma JST PRESTO, la Swiss National Science Foundation (31003A_149893 e 31003A_169548), il Consiglio europeo della ricerca (ERC-StG-311194), Novartis Foundation for Medical-Biomedical Research (13A39) e l’Università di Ginevra .
Materials
| KH2PO4 | Sigma-Aldrich | P5655 | I am not sure they are exactly the same ones we have in the lab. I chose "suitable for insect cell culture" whenever available |
| CaCl2 | Sigma-Aldrich | C7902 | |
| MgSO4.7H2O | Sigma-Aldrich | 230391 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S5886 | |
| NaHCO3 | Sigma-Aldrich | S5761 | |
| D-(+) Glucose | Sigma-Aldrich | G7021 | |
| Yeast extract | Sigma-Aldrich | Y1000 | |
| Insulin | Sigma-Aldrich | I0516-5ML | |
| Penicillin-Streptomycin | Sigma-Aldrich | P4333 | |
| BIS-TRIS | Sigma-Aldrich | B4429 | |
| L-(−)-Malic acid | Sigma-Aldrich | M7397 | |
| D-(+)-Trehalose dihydrate | Sigma-Aldrich | T0167 | |
| Succinic acid | Sigma-Aldrich | S9512 | |
| Fumaric acid | Sigma-Aldrich | F8509 | |
| α-Ketoglutaric acid | Sigma-Aldrich | K1128 | |
| Non-heat-inactivated, Foetal Calf Serum (FCS) Mycoplasma and Virus screened | BioConcept Ltd. Amimed | 2-01F30-I | |
| HEPES-KOH, pH 7.4 | E&K Scientific Products | EK-654011 | |
| KCl | Sigma-Aldrich | P5405 | |
| NaH2PO4 | Sigma-Aldrich | S5011 | |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | S7903 | |
| Fibrinogen from bovine plasma | Calbiochem (Merck) | 341573-1GM | CAUTION: Harmful by inhalation, in contact with skin and if swallowed. Manipulate under laminar flow |
| Thrombin from bovine plasma | Sigma-Aldrich | T9549 | CAUTION: Health Hazard, use gloves |
| PDF, NH2-NSELINSLLSLPKNMNDA-OH | Chi Scientific | custom made | |
| Vaccum grease | Sigma-Aldrich | 18405 | |
| 35 mm Dish, No. 1.5 Coverslip, 20 mm Glass Diameter, Uncoated | MatTek | P35G-1.5-20-C | |
| Corning Falcon Easy-Grip Tissue Culture Dishes | fisherscientific | 08-772A | |
| Sterile 500 mL Steritop-GP 33 mm threaded bottle top filter, 0.22 μm | Millipore | SCGPS05RE | |
| Polytetrafluoroethylene (PTFE) film | Dupont | 200A Teflon FEP Film | |
| Millex-HV Syringe Filter Unit, 0.45 µm, PVDF, 33 mm, gamma sterilized | Millipore | SLHV033RS | |
| Millex-GV Syringe Filter Unit, 0.22 µm, PVDF, 33 mm, gamma sterilized | Millipore | SLGV033RS | |
| Three-well glass dissection dish | Any company | ||
| Fine forceps, size 5, Dumont | Fine Science Tools | 11254-20 | |
| Tandem scanner inverted TCS SP5 confocal microscope, with resonant scanner and HyD photo-multiplier detectors | Leica microsystem CMS GmbH | ||
| Temperature control chamber | Life Imaging Services | The CUBE & BOX temperature control system, custom designed | |
| Stage-top humidity controller | Life Imaging Services | custom made | |
| Water Immersion Micro Dispenser: dispenser, extended micro-pump MP6 series and Autoimmersion Objective Controller software | Leica microsystem CMS GmbH | ||
| SUM-stack creation and 3D correction drift plugin | ImageJ software | ||
| 10x iterative deconvolution | AutoQuant and Imaris software |
Referenzen
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