Method Article

Einzellige Auflösung Fluoreszenz Imaging von Drosophila zirkadiane Uhren in Larven Gehirn Kultur Leben

DOI:

10.3791/57015

⸱

January 19th, 2018

 , 
1Department of Genetics and Evolution, University of Geneva

In This Article

Summary

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Das Ziel dieses Protokolls ist, ex Vivo Drosophila Larven Gehirn Kultur so optimiert, dass circadiane molekulare Rhythmen mit langfristigen Zeitraffer Fluoreszenz-Bildgebung überwachen zu etablieren. Die Anwendung dieser Methode auf pharmakologische Tests wird auch diskutiert.

Abstract

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Die zirkadianen Schrittmacher-Schaltung orchestriert rhythmische Verhaltens- und physiologischen Ausgänge mit ökologischen Hinweise, wie Tag/Nacht-Zyklen abgestimmt. Die molekulare Uhr innerhalb jedes Neuron Herzschrittmacher erzeugt zirkadianen Rhythmen in der Genexpression, die die rhythmischen neuronalen Funktionen wesentlich für den Betrieb der Schaltung zugrunde liegen. Untersuchung der Eigenschaften der einzelnen molekulare Oszillatoren in verschiedenen Unterklassen der Herzschrittmacher Neuronen und deren Zusammenspiel mit neuronalen Signal ergibt ein besseres Verständnis der zirkadianen Schrittmacher-Schaltung. Hier präsentieren wir Ihnen einen Zeitraffer-Fluoreszenz-Mikroskopie-Ansatz entwickelt, um die molekularen Uhrwerk in Uhr Neuronen des kultivierten Drosophila Larven Gehirn zu überwachen. Diese Methode ermöglicht die mehrtägige Aufzeichnung von den Rhythmen der genetisch codierten fluoreszierende circadiane Reporter bei einzelligen Auflösung. Dieses Setup ist kombinierbar mit pharmakologische Manipulationen zu Echtzeit-Reaktion der molekularen Uhr zu verschiedenen Verbindungen genau analysieren. Über zirkadianen Rhythmen bietet diese multifunktionale Methode in Kombination mit leistungsstarken Drosophila genetische Techniken die Möglichkeit verschiedene neuronale oder molekulare Prozesse in live Hirngewebe zu studieren.

Introduction

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Zirkadiane Uhren helfen Organismen zur Anpassung an die periodischen Veränderungen der Umwelt durch die 24-Stunden-Rotation der Erde erzeugt. Interlock transkriptionelle translationale Rückkopplungsschleifen unterliegen häufig der molekulare Maschinerie der zirkadianen Taktgeber über Arten1. Die zirkadianen Schrittmacher-Schaltung, bestehend aus Uhr-haltigen Neuronen integriert-Uhrzeit-Informationen vermittelt durch die Umwelt-Signale, wie hell/dunkel (LD) und Temperaturzyklen, die Rhythmen von einer Vielzahl von täglich zu orchestrieren physiologischen und Verhaltensstörungen Prozesse2,3

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Protocol

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1. Vorbereitung der Stammlösungen unter einem Kultur-Haube

  1. Bereiten Sie 400 mL 1 x Schneider aktives Medium (SAM) optimiert für ex-Vivo -Kultur der Larven Gehirne (geändert von Referenz-24,-25) (Tabelle 1). Aliquot 5 mL und Blitz Einfrieren in flüssigem Stickstoff (LN2), Lagerung bei - 80 ° C.
  2. Bereiten Sie 1 x Dissecting Kochsalzlösung (DSS) durch Verdünnung 10-fach-Stammlösung (geändert von Referenz-26) (Tabelle 2).
  3. Aliquoten Fibrinogen, 10 mg und bei 4 ° C für den einmaligen Gebrauch.
    Achtung: Wiege....

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Results

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Hier zeigen wir die repräsentativen Ergebnisse der langfristigen Aufnahme eines circadianen fluoreszierende Reporter in ex Vivo Larven Gehirn Kultur und bildgebenden Liveergebnisse PDF Bad Anwendung auf Reporter Ausdruck.

Non-wandering L3-Larven Ausdruck der molekularen Uhr Reporter pro-TDT und FH-mCD8::YFP, angetrieben von einem Uhr-Neuron-Fahrer Clk 856-gal4 (Abbildung 1) wurden .......

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Discussion

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Hier haben wir die Methode zur langfristigen Zeitraffer Fluoreszenzmikroskopie kultivierten Larven Gehirne beschrieben. Der Erfolg dieser Art von Experimenten hängt von mehreren Faktoren ab, wie die Gesundheit der Kultur, Methode zur Immobilisierung des Gehirns Explant, Fluoreszenzintensität und Signal-Rausch-Verhältnis der Reporter, zeitliche und räumliche Auflösung und Zugänglichkeit zu den Explant. Diese Faktoren können sich gegenseitig ausschließen. Zum Beispiel Zeitraffer Häufigkeit beeinflusst die Gesundheit der Ku.......

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Disclosures

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Die Autoren haben nichts preisgeben.

Acknowledgements

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Wir danken Michael Rosbash für seine Betreuung und Unterstützung während der Anfangsphase der Entwicklung dieser Methode. Diese Arbeit wurde vom JST PRESTO-Programm des Schweizer Nationalfonds (31003A_149893 und 31003A_169548), der Europäische Forschungsrat (ERC-StG-311194), Novartis Stiftung für medizinisch-biomedizinische Forschung (13A39) und der Universität Genf finanziert. .

....

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
KH2PO4Sigma-AldrichP5655Ich bin mir nicht sicher, ob es genau die gleichen sind, die wir im Labor haben. Wann immer verfügbar, habe ich "geeignet für Insektenzellkultur" gewählt
CaCl2Sigma-Aldrich,C7902
MgSO4.7H2O,Sigma-Aldrich230391
NaClSigma-AldrichS5886
NaHCO3Sigma-Aldrich,S5761
D-(+) GlukoseSigma-AldrichG7021
HefeextraktSigma-AldrichY1000
InsulinSigma-AldrichI0516-5ML
Penicillin-StreptomycinSigma-AldrichP4333
BIS-TRISSigma-AldrichB4429
L-(−)-ApfelsäureSigma-AldrichM7397
D-(+)-Trehalose-DihydratSigma-AldrichT0167
BernsteinsäureSigma-AldrichS9512
FumarsäureSigma-AldrichF8509
α-KetoglutarsäureSigma-AldrichK1128
Nicht hitzeinaktiviertes, fötales Kälberserum (FCS) Durch Mykoplasmen und Viren gescreentBioConcept Ltd. Amimed2-01F30-I
HEPES-KOH, PH 7,4E& K Scientific ProductsEK-654011
KClSigma-AldrichP5405
NaH2PO4Sigma-AldrichS5011
SaccharoseSigma-AldrichS7903
Fibrinogen aus RinderplasmaCalbiochem (Merck)341573-1GMACHTUNG: Gesundheitsschädlich durch Einatmen, bei Berührung mit der Haut und beim Verschlucken. Manipulieren Sie unter laminarer Strömung
Thrombin aus RinderplasmaSigma-AldrichT9549ACHTUNG: Gesundheitsgefahr, Handschuhe verwenden
PDF, NH2-NSELINSLLSLPKNMNDA-OHChi Scientificmaßgeschneidertes
VakuumfettSigma-Aldrich18405
35 mm Schale, Nr. 1,5 Deckglas, 20 mm Glasdurchmesser, unbeschichtetMatTekP35G-1.5-20-C
Corning Falcon Easy-Grip Gewebekulturschalenfisherscientific08-772A
Steriler 500 mL Steritop-GP 33 mm Flaschenaufsatzfilter mit Gewinde, 0,22 μ mMilliporeSCGPS05RE
Polytetrafluorethylen (PTFE)-FolieDupont200A Teflon-FEP-Folie
Millex-HV Spritzenfiltereinheit, 0,45  &Mikro; m, PVDF, 33  mm, gammasterilisiertMilliporeSLHV033RS
Millex-GV Spritzenfiltereinheit, 0,22  &Mikro; m, PVDF, 33  mm, gammasterilisiertMilliporeSLGV033RS
Drei-Well-Dissektionsschale aus GlasBeliebig Unternehmen
Feine Pinzette, Größe 5, DumontFine Science Tools11254-20
Tandem-Scanner inverses konfokales Mikroskop TCS SP5, mit Resonanzscanner und HyD-Photomultiplier-DetektorenLeica microsystem CMS GmbH
TemperierkammerLife Imaging ServicesDer CUBE & BOX-Temperaturregelungssystem, kundenspezifischer
Stage-Top-FeuchtereglerLife Imaging Serviceskundenspezifischer
Wasserimmersions-Mikrodispenser: Dispenser, erweiterte Mikropumpe MP6-Serie und Autoimmersion Objective Controller SoftwareLeica microsystem CMS GmbH
SUM-Stack-Erstellung und 3D-Korrekturdrift-PluginImageJ Software
10x iterative DekonvolutionAutoQuant und Imaris Software
: , , , , ,

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Sheeba, V., Kaneko, M., Sharma, V. K., Holmes, T. C. The Drosophila circadian pacemaker circuit: Pas De Deux or Tarantella? Crit Rev Biochem Mol Biol. 43 (1), 37-61 (2008).
  2. Granados-Fuentes, D., Herzog, E. D. The clock shop: coupled circadian oscillators. Exp Neurol.

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Drosophila Larval BrainFluorescence Live ImagingSingle cell ResolutionTime lapse MicroscopyCircadian Clock NeuronsFibrin Matrix EmbeddingGenetic Fluorescent ReportersMaximum Entropy AnalysisPharmacological ManipulationsEx Vivo Brain Culture

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