単一セルの解像度蛍光は住む幼虫脳文化のショウジョウバエ概日時計のイメージング
Summary
このプロトコルの目標は、前のヴィヴォ ショウジョウバエ幼虫の脳文化が長期的な蛍光タイムラプス イメージングの概日リズムの分子リズムを監視するために最適化を確立することです。このメソッドの薬理学的アッセイへの応用を論じた。
Abstract
概日時計の回路は、昼/夜サイクルなどの環境手がかりと連動したリズミカルな行動および生理学的な出力を調整します。各細胞内で分子時計は、回路の動作に必要なリズミカルな神経機能の根底にある遺伝子発現の概日リズムを生成します。ペース メーカー細胞のさまざまなサブクラスにおける個々 の分子振動子と神経信号との相互作用の性質の調査概日時計回路の理解が得られます。培養ショウジョウバエ幼虫脳の時計ニューロンの分子時計仕掛けを監視する開発タイムラプス蛍光顕微鏡のアプローチを紹介します。このメソッドは、単一セルの解像度で、遺伝子にエンコードされた蛍光概記者のリズムの複数日記録をできます。このセットアップは、さまざまな化合物を分子時計のリアルタイム応答の詳細に解析する薬理学的操作と組み合わせることができます。概日リズムを超えて強力なショウジョウバエの遺伝学的手法との組み合わせでこの多目的メソッドは生きている脳組織の多様な神経細胞や分子プロセスを勉強する可能性を提供しています。
Introduction
体内時計は、地球の 24 時間の自転によって生成された定期的な環境変化に適応する生物を助けます。インタロックされた転写翻訳フィード バック ループ一般種1にわたって概日時計の分子機械を根底します。概日時計回路構成の時計を含むニューロンの統合環境手がかり、明/暗 (LD) や毎日の茄多のリズムを調整するための温度サイクルなどによって伝えられる時刻の情報生理と行動プロセス2,3。分子リズム神経の入力と出力の調整は概日リズム回路ですが部分的にしか理解されて残るの操作にきわめて重要です。
ショウジョウバエの分子時計のコアでクロック (CLK/サイク) ヘテロダイマーをアクティブに期間(あたり) の転写と時代を超越した(ティム)。あたりとティムは、複合体を形成し、彼らは CLK/サイクとその結果自分の転写の転写活性を阻害する核を入力します。CLK/サイクを介した転写とあたりで抑圧の間の遅延が発生する転写と翻訳後の規制/ティムは、24 h の分子振動1,3,4年頃の世代を確保します。.これらの分子時計のフォームを含む約 150 のニューロン大人の行動の日周性制御回路は飛ぶ5です。くらい簡単で完全に機能的な概日リズム回路時計ニューロン – 5 腹側外側ニューロン (LNvs; 4 PDF 陽性 LNvs および以下を参照してください 1 つの PDF 負 LNv)、2 背側ニューロン 1 s (DN1s) と 2 の背側ニューロン 2 s (DN2s) – の 3 つのグループから成るが、幼虫の存在脳6,7。
シンプルな幼虫体内回路間神経回路と分子時計の相互作用を研究するための優れたモデルを提供しています。我々 は分子時計仕掛け幼虫体内回路で異なるクロック ニューロン群のダイナミクスを特徴付けるしようと新しく開発された蛍光レポーターあたり TDT、蛋白質および細胞内ロケーションごとのレベルを模倣を使用して8ですさらに、我々 神経レベル9,,1011で概日リズムの調節に 4 LNvs によって生成されるペプチド顔料分散係数 (PDF) の重要な役割を知ることには、直接を調べたい。分子時計の PDF の効果。このため、幼虫の脳のリズムは、複数日にわたるタイムラプス共焦点顕微鏡による外植体概日遺伝子の発現を監視する方法を開発しました。プロトコルは、TDT のあたりのレベルに及ぼす PDF または他の化合物をテストする薬理学的アッセイにも適応されました。したがって、適応は、脳培養を薬物のアプリケーションにアクセスできるように、時間的解像度は高く、短い期間のためのイメージングで構成されます。
発達段階別のショウジョウバエ脳の前のヴィヴォ文化はずっと以前に確立された12,13,14,15,16,17 ,18。これらのプロトコルは、さまざまな生物学的現象のイメージングのために使用されているに対し、それらのいくつかは単一セルの解像度で画像と互換性がないまたは数時間以上の文化をサポートしていません。ショウジョウバエの概日リズム神経細胞の長期のライブ イメージングを実行する代替方法など分子リズム19,20,21の生物発光イメージングの蛍光イメージング光シート顕微鏡22,23カルシウム インジケーター。生物発光イメージングは、高い時間分解能を達成できる、光シート顕微鏡は生体内イメージングのため適応することができますが、彼らは空間分解能に限られている、特殊な顕微鏡システムが必要があります。
ここで説明する方法は、複数日にわたる単一セルの解像度で全脳文化の蛍光信号を視覚化するために合わせて調整されます。この安易な汎用性の高い方法は、ショウジョウバエの神経生物学のさまざまな問題を研究する薬理学的実験、培養画像アダルト飛ぶ脳に合わせることができます。
Protocol
Representative Results
Discussion
ここで長期培養の幼虫の脳の蛍光タイムラプス顕微鏡法について述べる。このタイプの実験の成功によって異なります文化、健康などの複数の要因脳植、蛍光強度、記者、時間と空間分解能の信号対雑音比の固定方法と外植体へのアクセシビリティ。これらの要因は相互に排他的にすることができます。たとえば、文化の健康に影響するタイムラプス周波数の増加、脳外植体の固定化は、ガ?…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
我々 は彼の指導のマイケル Rosbash に感謝し、このメソッドの開発の初期段階をサポートします。科学技術振興機構さきがけプログラムによって、スイスの全米科学財団 (31003A_149893 と 31003A_169548)、欧州研究評議会 (ERC-ポンド-311194)、ノバルティス財団法人医療医学研究 (13A39)、ジュネーブの大学資金が供給されたこの作品.
Materials
| KH2PO4 | Sigma-Aldrich | P5655 | I am not sure they are exactly the same ones we have in the lab. I chose "suitable for insect cell culture" whenever available |
| CaCl2 | Sigma-Aldrich | C7902 | |
| MgSO4.7H2O | Sigma-Aldrich | 230391 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S5886 | |
| NaHCO3 | Sigma-Aldrich | S5761 | |
| D-(+) Glucose | Sigma-Aldrich | G7021 | |
| Yeast extract | Sigma-Aldrich | Y1000 | |
| Insulin | Sigma-Aldrich | I0516-5ML | |
| Penicillin-Streptomycin | Sigma-Aldrich | P4333 | |
| BIS-TRIS | Sigma-Aldrich | B4429 | |
| L-(−)-Malic acid | Sigma-Aldrich | M7397 | |
| D-(+)-Trehalose dihydrate | Sigma-Aldrich | T0167 | |
| Succinic acid | Sigma-Aldrich | S9512 | |
| Fumaric acid | Sigma-Aldrich | F8509 | |
| α-Ketoglutaric acid | Sigma-Aldrich | K1128 | |
| Non-heat-inactivated, Foetal Calf Serum (FCS) Mycoplasma and Virus screened | BioConcept Ltd. Amimed | 2-01F30-I | |
| HEPES-KOH, pH 7.4 | E&K Scientific Products | EK-654011 | |
| KCl | Sigma-Aldrich | P5405 | |
| NaH2PO4 | Sigma-Aldrich | S5011 | |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | S7903 | |
| Fibrinogen from bovine plasma | Calbiochem (Merck) | 341573-1GM | CAUTION: Harmful by inhalation, in contact with skin and if swallowed. Manipulate under laminar flow |
| Thrombin from bovine plasma | Sigma-Aldrich | T9549 | CAUTION: Health Hazard, use gloves |
| PDF, NH2-NSELINSLLSLPKNMNDA-OH | Chi Scientific | custom made | |
| Vaccum grease | Sigma-Aldrich | 18405 | |
| 35 mm Dish, No. 1.5 Coverslip, 20 mm Glass Diameter, Uncoated | MatTek | P35G-1.5-20-C | |
| Corning Falcon Easy-Grip Tissue Culture Dishes | fisherscientific | 08-772A | |
| Sterile 500 mL Steritop-GP 33 mm threaded bottle top filter, 0.22 μm | Millipore | SCGPS05RE | |
| Polytetrafluoroethylene (PTFE) film | Dupont | 200A Teflon FEP Film | |
| Millex-HV Syringe Filter Unit, 0.45 µm, PVDF, 33 mm, gamma sterilized | Millipore | SLHV033RS | |
| Millex-GV Syringe Filter Unit, 0.22 µm, PVDF, 33 mm, gamma sterilized | Millipore | SLGV033RS | |
| Three-well glass dissection dish | Any company | ||
| Fine forceps, size 5, Dumont | Fine Science Tools | 11254-20 | |
| Tandem scanner inverted TCS SP5 confocal microscope, with resonant scanner and HyD photo-multiplier detectors | Leica microsystem CMS GmbH | ||
| Temperature control chamber | Life Imaging Services | The CUBE & BOX temperature control system, custom designed | |
| Stage-top humidity controller | Life Imaging Services | custom made | |
| Water Immersion Micro Dispenser: dispenser, extended micro-pump MP6 series and Autoimmersion Objective Controller software | Leica microsystem CMS GmbH | ||
| SUM-stack creation and 3D correction drift plugin | ImageJ software | ||
| 10x iterative deconvolution | AutoQuant and Imaris software |
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