단일 셀 해상도 형광 애벌레 뇌 문화에 살고 있는 초파리 Circadian Clock의 이미징
Summary
이 프로토콜의 목표는 ex vivo 초파리 애벌레 뇌 문화를 장기 형광 시간 경과 영상 분자 circadian 리듬을 모니터링 하기 위해 최적화 설정입니다. 이 방법의 약리학 분석 응용 프로그램 또한 토론 된다.
Abstract
Circadian 맥 박 조정기 회로 리듬 행동과 생리 적인 출력 일 또는 밤 주기 등 환경 신호 조정 총괄. 각 맥 박 조정기 뉴런 내에서 분자 시계 유전자 발현, 기초 회로의 작동에 필수적인 리듬 신경 기능에에서 circadian 리듬을 생성 합니다. 맥 박 조정기의 다른 서브 클래스에서 개별 분자 발진기와 신경 신호와 상호 작용의 속성의 조사 circadian 맥 박 조정기 회로의 더 나은 이해를 생성 합니다. 여기, 우리 제시 시간 경과 형광 현미경 접근 시계 교양된 초파리 애벌레 두뇌의 신경에 있는 분자 시계를 모니터링 하기 위해 개발. 이 메서드는 단일 셀 해상도 유전자 인코딩된 형광 circadian 기자의 리듬의 여러 날 녹음을 수 있습니다. 이 설치 밀접 하 게 다양 한 화합물의 분자 시계 실시간 응답을 분석 하는 약리 조작 결합 될 수 있다. Circadian 리듬, 넘어 강력한 초파리 유전자 기술 함께에서이 다목적 방법 라이브 뇌 조직에서 다양 한 신경 분자 과정을 공부 하는 가능성을 제공 합니다.
Introduction
Circadian 시계 도움이 지구의 24 시간 회전에 의해 생성 된 주기적인 환경 변화에 적응 하는 생물. 연동된 transcriptional 변환 피드백 루프는 일반적으로 종1에 걸쳐 circadian clock의 분자 기계를 기반이 됩니다. Circadian 심장 박 동기 회로 구성 포함 하는 클록의 명암 (LD) 등 통합 하는 매일의 과다의 리듬을 온도 사이클 환경 단서에 의해 전달 하는 일의 시간 정보를 통합 하는 신경 생리와 행동 프로세스2,3. 신경 입력 / 출력을 갖는 분자 리듬의 조정 circadian 회로 하지만 부분적 으로만 이해 하는 남아의 작업에 대 한 비판적으로 중요 하다.
초파리, 분자 시계의 코어에 클록/사이클 (CLK/CYC) heterodimer 활성화 기간 (당)의 전사와 영원한 (팀). 당 및 팀 복합물을 형성 하 고 그들은 CLK/CYC 그리고 결과적으로 그들의 자신의 전사의 transcriptional 활동을 억제 핵를 입력 합니다. Post-transcriptional 및 포스트 번역 상 규정 CLK/CYC-중재 전사와 당에 의해 억압 사이 지연이 발생할 / 팀, 24 h 분자 진동1,,34 년경의 세대를 보장 . 이러한 분자 시계 폼을 포함 하는 약 150 신경 성인 circadian 동작을 제어 하는 회로5를이동 합니다. 훨씬 더 간단한 아직 완전 하 게 작동 circadian 회로-5 복 부 측면 뉴런 (LNvs; 4 PDF 확실성 LNvs 및 하나의 PDF 음수가 LNv, 아래 참조), 2 등 쪽 신경 1 (DN1s)과 2 등 쪽 신경 2s (DN2s)-시계 뉴런의 3 그룹의 구성 된는 애벌레에 존재 하는 뇌6,7.
간단한 애벌레 circadian 회로 간 신경 통신 및 분자 시계 사이의 상호 작용을 공부 하는 우수한 모델을 제공 합니다. 우리의 새로 개발된 된 형광 기자 당-TDT를 단백질의 subcellular 위치 당의 수준, 모방을 사용 하 여 우리 하고자 했다 애벌레 circadian 회로 에 다른 시계 신경 하위 그룹에 분자 시계의 역학 특성 8. 또한, 4 LNvs 신경 레벨9,,1011circadian 리듬을 조절에 의해 생산 하는 neuropeptide 안료 분산 요소 (PDF)의 핵심적인 역할을 알고, 우리가 하 고 싶 었 직접 검사 분자 시계에 PDF의 효과입니다. 이 위해, 우리는 애벌레 뇌에서 리듬 시간 경과 confocal 현미경 검사 법에 의해 여러 일 동안 explant circadian 유전자 발현을 모니터링 하는 방법을 개발 했다. 프로토콜 당 TDT의 수준에 PDF 또는 다른 화합물의 효과 테스트 하는 약리 분석 실험에 대 한 적응도 했다. 따라서, 적응 뇌 explant 문화 약물 응용 프로그램에 액세스할 수 만들기, 시간적 해상도 증가 하 고 짧은 기간에 대 한 이미징 구성 되어 있습니다.
다른 발달 단계에의 초파리 두뇌의 비보 전 문화 이전 설립된12,13,,1415,16,17 되었습니다. ,18. 반면 이러한 프로토콜 이미징 다양 한 생물학 현상에 대 한 사용 되었습니다, 그들 중 일부는 단일 셀 해상도 이미지와 호환 되지 않는 또는 몇 시간에 대 한 문화를 지원 하지 않습니다. 초파리 에서 circadian 뉴런의 장기 라이브 영상을 수행 하는 대체 방법을 분자 리듬19,,2021 의 생물 발광 영상 등의 형광 이미징 칼슘 표시기 빛 시트 현미경22,23. 생물 발광 영상 더 높은 시간 해상도 얻을 수 있지만 가벼운 시트 현미경 vivo에서 화상 진 찰에 대 한 적응 하실 수 있습니다 그들은 공간 해상도에 제한 되 고 특수 현미경 시스템 필요.
여기 설명 하는 방법은 여러 일 동안 단일 셀 해상도에서 전체 뇌 문화에 형광 신호를 시각화 하기 위해 지어진 다. 이 손쉬운 방법과 다양 한 교양 이미지 성인 비행 두뇌와 초파리 신경 생물학에 있는 많은 다른 문제를 연구 하는 약리 실험에 대 한 적응 될 수 있습니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
여기 우리 교양된 애벌레 머리의 장기 형광 시간 경과 현미경에 대 한 방법을 설명합니다. 이 유형의 실험의 성공에 따라 달라 집니다 문화, 건강 등의 여러 요소 두뇌 explant, 형광 강도 및 기자, 시간적 및 공간적 해상도의 신호 대 잡음 비율의 동원 정지를 위한 방법 및 explant에 대 한 접근 이러한 요소는 상호 배타적 될 수 있습니다. 예, 문화, 건강에 영향을 미치는 시간 경과 주파수를 증가 하 고 …
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
우리는 그의 멘토링에 대 한 마이클 Rosbash를 감사 하 고이 방법의 개발의 초기 단계 지원. 이 작품은 JST 프레스 토 프로그램, 스위스 국립 과학 재단 (31003A_149893 및 31003A_169548), 유럽 연구 회의 (ERC-StG-311194), 노바 티 스 의료 생물 의학 연구 (13A39)에 대 한 재단과 제네바의 대학에 의해 투자 되었다 .
Materials
| KH2PO4 | Sigma-Aldrich | P5655 | I am not sure they are exactly the same ones we have in the lab. I chose "suitable for insect cell culture" whenever available |
| CaCl2 | Sigma-Aldrich | C7902 | |
| MgSO4.7H2O | Sigma-Aldrich | 230391 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S5886 | |
| NaHCO3 | Sigma-Aldrich | S5761 | |
| D-(+) Glucose | Sigma-Aldrich | G7021 | |
| Yeast extract | Sigma-Aldrich | Y1000 | |
| Insulin | Sigma-Aldrich | I0516-5ML | |
| Penicillin-Streptomycin | Sigma-Aldrich | P4333 | |
| BIS-TRIS | Sigma-Aldrich | B4429 | |
| L-(−)-Malic acid | Sigma-Aldrich | M7397 | |
| D-(+)-Trehalose dihydrate | Sigma-Aldrich | T0167 | |
| Succinic acid | Sigma-Aldrich | S9512 | |
| Fumaric acid | Sigma-Aldrich | F8509 | |
| α-Ketoglutaric acid | Sigma-Aldrich | K1128 | |
| Non-heat-inactivated, Foetal Calf Serum (FCS) Mycoplasma and Virus screened | BioConcept Ltd. Amimed | 2-01F30-I | |
| HEPES-KOH, pH 7.4 | E&K Scientific Products | EK-654011 | |
| KCl | Sigma-Aldrich | P5405 | |
| NaH2PO4 | Sigma-Aldrich | S5011 | |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | S7903 | |
| Fibrinogen from bovine plasma | Calbiochem (Merck) | 341573-1GM | CAUTION: Harmful by inhalation, in contact with skin and if swallowed. Manipulate under laminar flow |
| Thrombin from bovine plasma | Sigma-Aldrich | T9549 | CAUTION: Health Hazard, use gloves |
| PDF, NH2-NSELINSLLSLPKNMNDA-OH | Chi Scientific | custom made | |
| Vaccum grease | Sigma-Aldrich | 18405 | |
| 35 mm Dish, No. 1.5 Coverslip, 20 mm Glass Diameter, Uncoated | MatTek | P35G-1.5-20-C | |
| Corning Falcon Easy-Grip Tissue Culture Dishes | fisherscientific | 08-772A | |
| Sterile 500 mL Steritop-GP 33 mm threaded bottle top filter, 0.22 μm | Millipore | SCGPS05RE | |
| Polytetrafluoroethylene (PTFE) film | Dupont | 200A Teflon FEP Film | |
| Millex-HV Syringe Filter Unit, 0.45 µm, PVDF, 33 mm, gamma sterilized | Millipore | SLHV033RS | |
| Millex-GV Syringe Filter Unit, 0.22 µm, PVDF, 33 mm, gamma sterilized | Millipore | SLGV033RS | |
| Three-well glass dissection dish | Any company | ||
| Fine forceps, size 5, Dumont | Fine Science Tools | 11254-20 | |
| Tandem scanner inverted TCS SP5 confocal microscope, with resonant scanner and HyD photo-multiplier detectors | Leica microsystem CMS GmbH | ||
| Temperature control chamber | Life Imaging Services | The CUBE & BOX temperature control system, custom designed | |
| Stage-top humidity controller | Life Imaging Services | custom made | |
| Water Immersion Micro Dispenser: dispenser, extended micro-pump MP6 series and Autoimmersion Objective Controller software | Leica microsystem CMS GmbH | ||
| SUM-stack creation and 3D correction drift plugin | ImageJ software | ||
| 10x iterative deconvolution | AutoQuant and Imaris software |
Referenzen
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