Digitale PCR voor het kwantificeren van de circulerende MicroRNAs in acuut myocardinfarct en hart-en vaatziekten
Summary
Circulerende microRNAs is gebleken belofte als biomarkers voor cardiovasculaire aandoeningen en acuut myocardiaal infarcten. In deze studie beschrijven we een protocol voor extractie van miRNA, omgekeerde transcriptie en digitale PCR voor de absolute kwantificering van miRNAs in het serum van patiënten met hart-en vaatziekten.
Abstract
Circulerende serum microRNAs (miRNAs) is gebleken belofte als biomarkers voor de hart-en vaatziekten en acuut myocardinfarct (AMI), vrijgelaten uit de cardiovasculaire cellen in de circulatie. Circulerende miRNAs zijn zeer stabiel en kunnen worden gekwantificeerd. De kwantitatieve expressie van specifieke miRNAs kan worden gekoppeld aan de pathologie, en sommige miRNAs Toon hoge weefsel en de specificiteit van de ziekte. Het vinden van nieuwe biomarkers voor cardiovasculaire aandoeningen is van belang voor medisch onderzoek. Vrij recentelijk heeft digitale polymerase-kettingreactie (dPCR) uitgevonden. dPCR, gecombineerd met fluorescerende hydrolyse sondes, kan specifieke directe absolute kwantificering. dPCR vertoont superieure technische kwaliteiten, met inbegrip van een lage variabiliteit, hoge lineariteit en hoge gevoeligheid ten opzichte van de kwantitatieve polymerase chain reaction (qPCR). DPCR is dus een meer nauwkeurige en reproduceerbare methode voor rechtstreeks het kwantificeren van miRNAs, met name voor het gebruik in grote multi center cardiovasculaire klinische proeven. In deze publicatie beschrijven we het effectief uitvoeren van digitale PCR teneinde de absolute exemplaaraantal in serummonsters.
Introduction
Circulerende miRNAs hebben geïdentificeerd als veelbelovende markers voor een aantal ziekten, waaronder hart-en vaatziekten1. De miRNAs zijn kleine, niet-coderende single-stranded RNA moleculen (ongeveer 22 nucleotiden lang) betrokken zijn in de post-transcriptional verordening via de wijziging van de boodschapper-RNA vertaling en beïnvloeden gene expression2, en worden vrijgegeven in de circulatie in zowel fysiologische en pathologische staten. De kwantitatieve expressie van specifieke miRNAs kan worden gekoppeld aan de pathologie, en sommige miRNAs tonen hoog weefsel en ziekte specificiteit1. Cardiovasculaire aandoeningen, miRNAs geworden aantrekkelijke kandidaten als nieuwe biomarkers omdat ze opmerkelijk stabiel in het serum zijn en gemakkelijk kunnen worden gekwantificeerd met behulp van PCR methode3. De potentiële waarde van miRNAs als biomarkers voor myocardiaal infarct is geëvalueerd in kleine studies, maar een validatie in grote cohorten ontbreekt2. Bijvoorbeeld, miR-499 komt sterk uitgedrukt in de myocardiale spier, en het is aangetoond dat aanzienlijk worden verhoogd in een AMI4,5,6. Verder regelt het geprogrammeerde celdood (apoptose) en de differentiatie van cardiomyocytes en gaat dus in verschillende mechanismen na een AMI-7. Afgezien van enkele kleine studies rapporteren een superioriteit en incrementele waarde van miRNAs voor de diagnose van AMI, is de superioriteit of gelijkheid aan hoog-gevoeligheids cardiale troponins niet nog bewezen in grootschalig onderzoek2,5 ,6,8. Meer prospectieve studies in grote cohorten zijn, daarom, nodig voor de beoordeling van de potentiële diagnostische waarde van miRNAs. Bovendien, methoden van miRNA kwantificering moeten worden geoptimaliseerd en9gestandaardiseerde met behulp van vergelijkbare protocollen. Gestandaardiseerde testen inconsistente resultaten kunnen verminderen en kunnen helpen miRNAs te worden van mogelijke biomarkers voor de routinematige klinische toepassing, zoals biomarkers worden gekwantificeerd in een reproduceerbare manier moeten om hun klinische toepasbaarheid.
Onlangs, dPCR is ingevoerd als een eindpunt analyse. Het partities van het monster in ongeveer 20.000 individuele reacties10. Vervolgens het dPCR-systeem maakt gebruik van een wiskundige Poisson statistische analyse van fluorescerende signalen (positieve en negatieve reacties), waardoor een absolute kwantificering zonder een standaard curve10. Bij het combineren van dPCR met fluorescerende hydrolyse sondes, is de zeer specifieke directe absolute kwantificering van miRNAs mogelijk gemaakt. Digitale polymerase-kettingreactie heeft aangetoond dat het vertonen van superieure technische kwaliteiten (met inbegrip van een verminderde variabiliteit, een grotere dagelijkse reproduceerbaarheid, een hoge mate van lineariteit en een hoge gevoeligheid) voor het kwantificeren van miRNA niveaus in de verkeer in vergelijking met kwantitatieve real-time PCR10,11. Deze superieure technische kwaliteiten kunnen helpen verlichten van de huidige beperkingen op het gebruik van de circulerende miRNAs als biomarkers en kunnen leiden tot de oprichting van miRNAs als biomarkers in grote multi center cardiovasculaire klinische proeven en als een diagnostische methode in algemene. In een eerdere studie, wij onlangs toegepast dPCR voor de absolute kwantificering van de circulerende miRNAs bij patiënten met een AMI en waren in staat om aan te tonen van superieure diagnostische mogelijkheden in vergelijking met de kwantificering van miRNAs door qPCR12.
In deze publicatie willen we aantonen dat het gebruik van dPCR een nauwkeurige en reproduceerbare methode is voor rechtstreeks kwantificeren cardiovasculaire miRNAs circuleren. De absolute kwantificering van miRNA niveaus in het serum, met behulp van digitale PCR, toont het potentieel voor het gebruik in grote multi center cardiovasculaire klinische proeven. In deze publicatie beschrijven we in detail hoe effectief uitvoeren van digitale PCR en hoe om te ontdekken de absolute miRNA exemplaaraantal in serum.
Protocol
Representative Results
Discussion
Digitale PCR is een relatief nieuwe eindpunt methode van PCR waarmee de directe absolute kwantificering van nucleïnezuren binnen een steekproef. De methode heeft bepaalde voordelen, zoals een verminderde variabiliteit, een grotere dagelijkse reproduceerbaarheid en een superieure gevoeligheid11,12. Verder, als gevolg van het partitioneren van het monster in ongeveer 20.000 enkele reacties en eindpunt analyses, dPCR is robuuster aan storende stoffen in PCR in verg…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
De auteurs hebben geen bevestigingen.
Materials
| RNA-Extraction | |||
| miRNeasy Serum/Plasma Kit (50) | Qiagen-Sample & Assay Technologies, Hilden, Deutschland | 217184 | Kit for microRNA extraction. Kit contains commercial buffer RWT (called number one in the manuscript) and RPE (called number two in manuscript). |
| miRNeasy Serum/Plasma Spike-in-Control; Syn-cel-miR-39 miRNA; 10pmol | Qiagen-Sample & Assay Technologies, Hilden, Deutschland | 219610 | Spike-in for normalisation , Sequence: 5'-UCACCGGGUGUAAAUCAGCUUG-3' |
| Reverse Transcription | |||
| TaqMan MicroRNA Reverse Transcription Kit (1000 Reactions) | Applied Biosystems, Inc., Foster City, CA, USA | 4366597 | Kit for microRNA reverse transcription |
| TaqMan MicroRNA Assays M | Applied Biosystems, Inc., Foster City, CA, USA | 4440887 | Assays used in reverse transcription |
| hsa-miR-499 (750 RT/750 PCR rxns) | Applied Biosystems, Inc., Foster City, CA, USA | 4440887 | Assay Number 001352 |
| cel-miR-39 (750 RT/750 PCR rxns) | Applied Biosystems, Inc., Foster City, CA, USA | 4440887 | Assay Number 000200 |
| PCR Plate, 96-well, segmented, semi-skirted | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA | AB0900 | 96 well plate for reverse transcription |
| Microseal ‘B’ seal Seals | Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, USA | MSB1001 | Foil to ensure proper storage |
| C1000 Touch Thermal Cycler | Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, USA | 1851196 | Cycler used for reverse transcription |
| Droplet Digital PCR | |||
| 100 nmole RNA oligo hsa-miR-499-5p | Integrated DNA Technologies | Custom | Sequence: 5'-phos-UUAAGACUUGCAGUGAUGUUU-3' |
| ddPCR Supermix for Probes (No dUTP) | Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, USA | 1863024 | Supermix used in droplet generation |
| TaqMan MicroRNA Assays | Applied Biosystems, Inc., Foster City, CA, USA | 4440887 | Assays used in digital PCR (fluorescent hydrolysis probe) |
| hsa-miR-499 (750 RT/750 PCR rxns) | Applied Biosystems, Inc., Foster City, CA, USA | 4440887 | Assay Number 001352, commercial primers |
| cel-miR-39 (750 RT/750 PCR rxns) | Applied Biosystems, Inc., Foster City, CA, USA | 4440887 | Assay Number 000200, commercial primers |
| DG8 Cartridges and Gaskets | Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, USA | 1864007 | Cartridge takes up to 8 samples for droplet generation |
| DG8 Cartridge Holder | Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, USA | 1863051 | Holds cartridges in droplet generation |
| Droplet Generation Oil for Probes | Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, USA | 1863005 | Oil used in droplet generation |
| ddPCR 96-Well Plates | Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, USA | 12001925 | 96 well plate for ddPCR |
| PCR Plate Heat Seal, foil, pierceable | Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, USA | 1814040 | Pierceable foil, compatible with droplet reader |
| ddPCR Droplet Reader Oil | Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, USA | 1863004 | Oil used in droplet reading |
| QX100 or QX200 Droplet Generator | Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, USA | 1863002 | Droplet Generator, generates the droplets from sample/oil emulsion |
| PX1 PCR Plate Sealer | Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, USA | 1814000 | Seals the plate before PCR |
| C1000 Touch Thermal Cycler | Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, USA | 1851196 | Cycler used for ddPCR |
| QX100 or QX200 Droplet Reader | Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, USA | 1863003 | Reads PCR-positive and PCR-negative droplets with an optical detector |
| ddPCR Buffer Control for Probes | Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, USA | 1863052 | Blank control and to fill up the remaining wells of 8-well cassette |
| Software | |||
| QuantaSof Software | Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, USA | 1864011 | Program for droplet reading |
| Prism Windows 5 | GraphPad Software Inc., La Jolla, CA, USA | Program for statistical analysis |
Referenzen
- Schulte, C., Zeller, T. microRNA-based diagnostics and therapy in cardiovascular disease – summing up the facts. Cardiovascular Diagnosis and Therapy. 5, 17-36 (2015).
- Sun, T., et al. The role of microRNAs in myocardial infarction: from molecular mechanism to clinical application. International Journal of Molecular Sciences. 18, (2017).
- Dimmeler, S., Zeiher, A. M. Circulating microRNAs: novel biomarkers for cardiovascular diseases. European Heart Journal. 31, 2705-2707 (2010).
- Creemers, E. E., Tijsen, A. J., Pinto, Y. M. Circulating microRNAs: novel biomarkers and extracellular communicators in cardiovascular disease. Circulation Research. 110, 483-495 (2012).
- Oerlemans, M. I., et al. Early assessment of acute coronary syndromes in the emergency department: the potential diagnostic value of circulating microRNAs. EMBO Molecular Medicine. 4, 1176-1185 (2012).
- Olivieri, F., et al. Diagnostic potential of circulating miR-499-5p in elderly patients with acute non ST-elevation myocardial infarction. Internation Journal of Cardiology. 167, 531-536 (2013).
- Navickas, R., et al. Identifying circulating microRNAs as biomarkers of cardiovascular disease: a systematic review. Cardiovascular Research. 111, 322-337 (2016).
- Devaux, Y., et al. Diagnostic and prognostic value of circulating microRNAs in patients with acute chest pain. Journal of Internal Medicine. 277, 260-271 (2015).
- Schwarzenbach, H., da Silva, A. M., Calin, G., Pantel, K. Data normalization strategies for microRNA quantification. Clinical Chemistry. 61, 1333-1342 (2015).
- Hindson, B. J., et al. High-throughput droplet digital PCR system for absolute quantitation of DNA copy number. Analytical Chemistry. 83, 8604-8610 (2011).
- Hindson, C. M., et al. Absolute quantification by droplet digital PCR versus analog real-time PCR. Nature Methods. 10, 1003-1005 (2013).
- Robinson, S., et al. Droplet digital PCR as a novel detection method for quantifying microRNAs in acute myocardial infarction. Internation Journal of Cardiology. 257, 247-254 (2018).
- Mitchell, P. S., et al. Circulating microRNAs as stable blood-based markers for cancer detection. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. , 10513-10518 (2008).
- D’Alessandra, Y., et al. Circulating microRNAs are new and sensitive biomarkers of myocardial infarction. European Heart Journal. 31, 2765-2773 (2010).
- Forootan, A., et al. Methods to determine limit of detection and limit of quantification in quantitative real-time PCR (qPCR). Biomolecular Detection and Quantification. 12, 1-6 (2017).
- Dingle, T. C., Sedlak, R. H., Cook, L., Jerome, K. R. Tolerance of droplet-digital PCR vs real-time quantitative PCR to inhibitory substances. Clinical Chemistry. 59, 1670-1672 (2013).
- Taylor, S. C., Laperriere, G., Germain, H. Droplet digital PCR versus qPCR for gene expression analysis with low abundant targets: from variable nonsense to publication quality data. Scientific Reports. 7, 2409 (2017).
