PCR digitale per quantificare circolanti microRNA nell'infarto miocardico acuto e la malattia cardiovascolare
Summary
MicroRNA circolanti hanno indicato la promessa come biomarcatori per malattie cardiovascolari e infarti miocardici acuti. In questo studio, descriviamo un protocollo per l’estrazione di miRNA, trascrizione d’inversione e digitali PCR per la quantificazione assoluta dei miRNA nel siero dei pazienti con la malattia cardiovascolare.
Abstract
Circolanti nel siero i microRNA (Mirna) hanno indicato la promessa come biomarcatori per la malattia cardiovascolare ed infarto miocardico acuto (AMI), rilasciato dalle cellule cardiovascolari nella circolazione. Mirna circolanti sono altamente stabili e possono essere quantificati. L’espressione quantitativa di miRNA specifici possa essere collegato per la patologia e alcuni miRNA Visualizza alta tessuto e specificità di malattia. Trovare nuovi biomarcatori per le malattie cardiovascolari è di importanza per la ricerca medica. Abbastanza recentemente, reazione a catena della polimerasi digitale (dPCR) è stata inventata. dPCR, combinato con sonde fluorescenti idrolisi, consente specifica diretta quantificazione assoluta. dPCR esibisce qualità tecniche superiori, tra cui una bassa variabilità, alta linearità e alta sensibilità rispetto alla reazione a catena della polimerasi quantitativa (qPCR). Così, dPCR è un metodo più accurato e riproducibile per quantificare direttamente Mirna, specialmente per l’uso in ampi studi clinici cardiovascolari del multi-center. In questa pubblicazione, descriviamo come eseguire efficacemente PCR digitale al fine di valutare il numero di copia assoluta nei campioni di siero.
Introduction
Mirna circolanti sono stati identificati come promettenti marcatori per un certo numero di malattie, compreso la malattia cardiovascolare1. I miRNA sono piccoli, non codificanti molecole di RNA singolo-incagliato (lunghe circa 22 nucleotidi) sono coinvolti nella regolazione post-trascrizionale attraverso l’alterazione della traduzione di RNA messaggero e d’influenza gene expression2 e vengono rilasciati nella circolazione negli Stati sia fisiologiche che patologiche. L’espressione quantitativa di miRNA specifici possa essere collegato alla patologia e alcuni miRNA Mostra alto tessuto e malattia specificità1. Nelle malattie cardiovascolari, Mirna sono diventati i candidati attraenti come nuovi biomarcatori perché sono notevolmente stabili nel siero e può facilmente essere quantificati con l’aiuto di PCR metodologia3. Il valore potenziale di Mirna come biomarcatori per infarto del miocardio è stato valutato in piccoli studi, ma una convalida in larghe coorti è carente2. Ad esempio, miR-499 è trovato altamente espressi nel muscolo del miocardio, e ha dimostrato di essere significativamente aumentata in un AMI4,5,6. Inoltre, esso regola programmato la morte delle cellule (apoptosi) e la differenziazione dei cardiomiociti e così è compreso in parecchi meccanismi segue un AMI7. A parte alcuni piccoli studi che riferiscono una superiorità e il valore incrementale di Mirna per la diagnosi di AMI, la superiorità o uguaglianza di alto-sensibilità troponine cardiache non è ancora stato dimostrato in studi su larga scala2,5 ,6,8. Ulteriori studi prospettici in larghe coorti sono, pertanto, necessari per valutare il potenziale valore diagnostico di Mirna. Inoltre, metodi di quantificazione di miRNA devono essere ottimizzate e9di protocolli standardizzati utilizzando comparabili. Analisi standardizzate possono ridurre risultati incoerenti e possono aiutare Mirna a diventare potenziali biomarcatori per l’applicazione clinica di routine, come biomarcatori devono essere quantificati in modo riproducibile per garantire la loro applicabilità clinica.
Recentemente, dPCR è stato introdotto come un’analisi di punto finale. Esso suddivide il campione in circa 20.000 reazioni individuali10. Il sistema di dPCR utilizza quindi una matematico Poisson analisi statistica dei segnali fluorescenti (reazioni positive e negative), che consente una quantificazione assoluta senza una curva standard10. Quando si combinano dPCR con sonde fluorescenti idrolisi, la quantificazione assoluta diretta altamente specifica dei miRNA è reso possibile. Reazione a catena della polimerasi digitale ha dimostrato che mostra qualità tecniche superiori (tra cui una variabilità in diminuzione, una maggiore riproducibilità quotidiana, un alto grado di linearità e un’alta sensibilità) per quantificare i livelli di miRNA nella circolazione rispetto al quantitativo in tempo reale PCR10,11. Queste qualità tecniche superiori potrebbe contribuire ad per attenuare le attuali limitazioni sull’utilizzo di Mirna circolanti come biomarcatori e può condurre all’istituzione di Mirna come biomarcatori in ampi studi clinici cardiovascolari del multi-center e come metodo diagnostico in generale. In uno studio precedente, abbiamo recentemente applicato dPCR per la quantificazione assoluta di Mirna in pazienti con IMA in circolazione e sono stati in grado di dimostrare il potenziale diagnostico superiore rispetto alla quantificazione dei miRNA qPCR12.
In questa pubblicazione, vogliamo dimostrare che l’utilizzo di dPCR è un metodo accurato e riproducibile per quantificare direttamente la circolazione cardiovascolari Mirna. La quantificazione assoluta di miRNA livelli nel siero, usando la PCR digitale, Mostra il potenziale per l’uso in ampi studi clinici cardiovascolari del multi-center. In questa pubblicazione, descriviamo in dettaglio come eseguire efficacemente PCR digitale e come rilevare il numero di copie di miRNA assoluta nel siero.
Protocol
Representative Results
Discussion
Digitale PCR è un metodo relativamente nuovo end-point di PCR che permette la quantificazione assoluta diretta degli acidi nucleici all’interno di un campione. Il metodo possiede particolari vantaggi, tra cui una variabilità in diminuzione, una maggiore riproducibilità quotidiana e una sensibilità superiore11,12. Inoltre, dovuto il partizionamento del campione in analisi di endpoint e circa 20.000 singole reazioni, dPCR è più robusto per sostanze interferen…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Gli autori non hanno nessun ringraziamenti.
Materials
| RNA-Extraction | |||
| miRNeasy Serum/Plasma Kit (50) | Qiagen-Sample & Assay Technologies, Hilden, Deutschland | 217184 | Kit for microRNA extraction. Kit contains commercial buffer RWT (called number one in the manuscript) and RPE (called number two in manuscript). |
| miRNeasy Serum/Plasma Spike-in-Control; Syn-cel-miR-39 miRNA; 10pmol | Qiagen-Sample & Assay Technologies, Hilden, Deutschland | 219610 | Spike-in for normalisation , Sequence: 5'-UCACCGGGUGUAAAUCAGCUUG-3' |
| Reverse Transcription | |||
| TaqMan MicroRNA Reverse Transcription Kit (1000 Reactions) | Applied Biosystems, Inc., Foster City, CA, USA | 4366597 | Kit for microRNA reverse transcription |
| TaqMan MicroRNA Assays M | Applied Biosystems, Inc., Foster City, CA, USA | 4440887 | Assays used in reverse transcription |
| hsa-miR-499 (750 RT/750 PCR rxns) | Applied Biosystems, Inc., Foster City, CA, USA | 4440887 | Assay Number 001352 |
| cel-miR-39 (750 RT/750 PCR rxns) | Applied Biosystems, Inc., Foster City, CA, USA | 4440887 | Assay Number 000200 |
| PCR Plate, 96-well, segmented, semi-skirted | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA | AB0900 | 96 well plate for reverse transcription |
| Microseal ‘B’ seal Seals | Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, USA | MSB1001 | Foil to ensure proper storage |
| C1000 Touch Thermal Cycler | Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, USA | 1851196 | Cycler used for reverse transcription |
| Droplet Digital PCR | |||
| 100 nmole RNA oligo hsa-miR-499-5p | Integrated DNA Technologies | Custom | Sequence: 5'-phos-UUAAGACUUGCAGUGAUGUUU-3' |
| ddPCR Supermix for Probes (No dUTP) | Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, USA | 1863024 | Supermix used in droplet generation |
| TaqMan MicroRNA Assays | Applied Biosystems, Inc., Foster City, CA, USA | 4440887 | Assays used in digital PCR (fluorescent hydrolysis probe) |
| hsa-miR-499 (750 RT/750 PCR rxns) | Applied Biosystems, Inc., Foster City, CA, USA | 4440887 | Assay Number 001352, commercial primers |
| cel-miR-39 (750 RT/750 PCR rxns) | Applied Biosystems, Inc., Foster City, CA, USA | 4440887 | Assay Number 000200, commercial primers |
| DG8 Cartridges and Gaskets | Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, USA | 1864007 | Cartridge takes up to 8 samples for droplet generation |
| DG8 Cartridge Holder | Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, USA | 1863051 | Holds cartridges in droplet generation |
| Droplet Generation Oil for Probes | Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, USA | 1863005 | Oil used in droplet generation |
| ddPCR 96-Well Plates | Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, USA | 12001925 | 96 well plate for ddPCR |
| PCR Plate Heat Seal, foil, pierceable | Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, USA | 1814040 | Pierceable foil, compatible with droplet reader |
| ddPCR Droplet Reader Oil | Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, USA | 1863004 | Oil used in droplet reading |
| QX100 or QX200 Droplet Generator | Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, USA | 1863002 | Droplet Generator, generates the droplets from sample/oil emulsion |
| PX1 PCR Plate Sealer | Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, USA | 1814000 | Seals the plate before PCR |
| C1000 Touch Thermal Cycler | Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, USA | 1851196 | Cycler used for ddPCR |
| QX100 or QX200 Droplet Reader | Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, USA | 1863003 | Reads PCR-positive and PCR-negative droplets with an optical detector |
| ddPCR Buffer Control for Probes | Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, USA | 1863052 | Blank control and to fill up the remaining wells of 8-well cassette |
| Software | |||
| QuantaSof Software | Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, USA | 1864011 | Program for droplet reading |
| Prism Windows 5 | GraphPad Software Inc., La Jolla, CA, USA | Program for statistical analysis |
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