PCR דיגיטלי עבור לכימות מחזורי מיקרו Rna חריפה אוטם שריר הלב, מחלות לב וכלי דם
Summary
מחזורי מיקרו Rna הראו הבטחה כמו סמנים ביולוגיים עבור infarctions אוטם אקוטי ומחלות לב וכלי דם. במחקר זה, אנו מתארים פרוטוקול miRNA החילוץ, שעתוק במהופך של PCR דיגיטלי עבור כימות מוחלטת של miRNAs בנסיוב של חולים עם מחלות לב וכלי דם.
Abstract
סרום מחזורי מיקרו Rna (miRNAs) הראו הבטחה כמו סמנים למחלות לב וכלי דם, אוטם אקוטי (עמי), ששוחרר מן התאים וכלי דם למחזור. MiRNAs מחזורי יציב מאוד, ניתן לכמת. ביטוי כמותי של miRNAs מסוים אפשר לקשר את הפתולוגיה, ואני קצת miRNAs הצג רקמות גבוהה וספציפיות המחלה. מציאת סמנים חדשניים למחלות לב וכלי דם יש חשיבות למחקר רפואי. די מזמן, הומצאה תגובת שרשרת של פולימראז דיגיטלי (dPCR). dPCR, בשילוב עם הגששים הידרוליזה פלורסנט, מאפשר מסוים כימות מוחלטת ישירה. dPCR תערוכות איכויות טכני מעולה, כולל השתנות נמוך, ליניאריות גבוהה, רגישות גבוהה בהשוואה את תגובת שרשרת של פולימראז כמותית (qPCR). לפיכך, dPCR היא שיטה לשחזור ומדויקת יותר ישירות לכימות תנועת miRNAs, במיוחד לשימוש רב מרכזי גדול לניסויים קליניים לב וכלי דם. בפרסום זה, אנו מתארים כיצד לבצע ביעילות PCR דיגיטלי כדי להעריך את המספר המוחלט עותק הדוגמאות סרום.
Introduction
מחזורי miRNAs זוהו כסמני מבטיח עבור מספר מחלות, כולל מחלות לב וכלי דם1. MiRNAs קטנות, ללא קידוד מולקולות RNA חד-גדילי (ארוך כ 22 נוקלאוטידים) מעורבים ב תקנת post-transcriptional ויה משינוי של RNA שליח תרגום וביטוי כמשפיע ג’ין2, הם שוחרר לתוך מחזור הדם במצבים פיזיולוגיים ופתולוגיים. ביטוי כמותי של miRNAs מסוימת יכולה להיות קשורה הפתולוגיה, ולהראות כמה miRNAs רקמות גבוה ומחלת ירידה לפרטים1. מחלות לב וכלי דם, miRNAs הפכו מועמדים אטרקטיביים כמו סמנים ביולוגיים הרומן כי הם יציב להפליא הנסיוב, יכול בקלות ניתן לכמת בעזרת PCR מתודולוגיה3. הערך הפוטנציאלי של miRNAs כמו סמנים ביולוגיים של אוטם שריר הלב יוערכו במחקרים קטנים, אך אימות בקוהורטות גדולות חסר2. לדוגמה, מיר-499 נמצא ביטוי מאוד שריר שריר הלב, זה הוכח להיות גדל באופן משמעותי ב-5,4,עמי6. עוד, זה מווסת מתוכנת מוות תאי (אפופטוזיס), את הבידול של cardiomyocytes, ובכך מעורב במספר מנגנונים בעקבות של עמי7. מלבד מספר מחקרים קטנים דיווח על עליונות של ערך מצטבר של miRNAs לאבחון של עמי, עליונות או מתוך שוויון רגישות גבוהה הלב troponins לא טרם הוכח מחקרים בקנה מידה גדול2,5 6, ,8. עוד מחקרים פוטנציאליים קוהורטות גדולות, לכן, נדרשים להעריך את ערכה אבחון פוטנציאל של miRNAs. בנוסף, שיטות של כימות miRNA צריך להיות מותאם, מתוקננת באמצעות השוואה פרוטוקולים9. מבחני סטנדרטית עשויה להפחית תוצאות לא עקביות, עשוי לסייע miRNAs להפוך פוטנציאל סמנים ביולוגיים עבור יישום קליני שגרתי, כמו סמנים ביולוגיים צריך ניתן לכמת באופן לשחזור כדי להבטיח שלהם ישימות קלינית.
לאחרונה, dPCR כבר הציג כמו ניתוח מובילים. זה מחיצות המדגם לתוך תגובות בודדות כ 20,00010. מערכת dPCR ואז מנצל מתמטית פואסון ניתוח סטטיסטי של אותות פלואורסצנט (תגובות חיוביות ושליליות), הפעלת של כימות מוחלט ללא עקומת תקן10. בעת שילוב dPCR עם הגששים הידרוליזה פלורסנט, כימות ספציפי מאוד מוחלטת ישירה של miRNAs התאפשר. תגובת שרשרת פולימראזית דיגיטלי הראה שהפגינו מעולה טכנית איכויות (כולל השתנות ירד, של הפארמצבטית היומיומית מוגברת, רמה גבוהה של ליניאריות, רגישות גבוהה) עבור לכימות רמות miRNA מחזור הדם בהשוואה כמותית בזמן אמת PCR10,11. מעולה טכנית יכול לעזור להקל על המגבלות הנוכחי על שימוש במחזור miRNAs סמנים ביולוגיים ואף עלולה להוביל הקמת miRNAs סמנים גדולים רב מרכזי ניסויים קליניים לב וכלי דם וכן שיטת אבחון ב כללי. במחקר הקודם, אנו לאחרונה חלה dPCR עבור כימות מוחלטת של מחזורי miRNAs בחולים עם עמי, הצליחו להדגים פוטנציאל אבחון מעולה בהשוואה כימות של miRNAs-qPCR12.
בפרסום זה, אנחנו רוצים להראות כי באמצעות dPCR היא שיטה לשחזור ומדויקים עבור ישירות לכימות במחזור miRNAs לב וכלי דם. כימות מוחלטת של רמות miRNA בסרום, באמצעות PCR דיגיטלי, פוטנציאל לשימוש רב מרכזי גדול לניסויים קליניים לב וכלי דם. בפרסום זה, נתאר בפירוט כיצד לבצע ביעילות PCR דיגיטלי וכיצד לזהות את המספר עותק miRNA מוחלטת בנסיוב.
Protocol
Representative Results
Discussion
PCR דיגיטלית היא שיטה יחסית הרומן מובילים של ה-PCR המאפשר כימות מוחלטת ישירה של חומצות גרעין בתוך מדגם. השיטה בעלת יתרונות מסוימים, כולל השתנות ירד, הפארמצבטית היומיומית מוגברת של רגישות מעולה11,12. יתרה מזאת, בשל חלוקת המדגם לתוך תגובות יחיד כ 20,000 וניתוחים קצה, dP…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
המחברים יש אין התודות.
Materials
| RNA-Extraction | |||
| miRNeasy Serum/Plasma Kit (50) | Qiagen-Sample & Assay Technologies, Hilden, Deutschland | 217184 | Kit for microRNA extraction. Kit contains commercial buffer RWT (called number one in the manuscript) and RPE (called number two in manuscript). |
| miRNeasy Serum/Plasma Spike-in-Control; Syn-cel-miR-39 miRNA; 10pmol | Qiagen-Sample & Assay Technologies, Hilden, Deutschland | 219610 | Spike-in for normalisation , Sequence: 5'-UCACCGGGUGUAAAUCAGCUUG-3' |
| Reverse Transcription | |||
| TaqMan MicroRNA Reverse Transcription Kit (1000 Reactions) | Applied Biosystems, Inc., Foster City, CA, USA | 4366597 | Kit for microRNA reverse transcription |
| TaqMan MicroRNA Assays M | Applied Biosystems, Inc., Foster City, CA, USA | 4440887 | Assays used in reverse transcription |
| hsa-miR-499 (750 RT/750 PCR rxns) | Applied Biosystems, Inc., Foster City, CA, USA | 4440887 | Assay Number 001352 |
| cel-miR-39 (750 RT/750 PCR rxns) | Applied Biosystems, Inc., Foster City, CA, USA | 4440887 | Assay Number 000200 |
| PCR Plate, 96-well, segmented, semi-skirted | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA | AB0900 | 96 well plate for reverse transcription |
| Microseal ‘B’ seal Seals | Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, USA | MSB1001 | Foil to ensure proper storage |
| C1000 Touch Thermal Cycler | Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, USA | 1851196 | Cycler used for reverse transcription |
| Droplet Digital PCR | |||
| 100 nmole RNA oligo hsa-miR-499-5p | Integrated DNA Technologies | Custom | Sequence: 5'-phos-UUAAGACUUGCAGUGAUGUUU-3' |
| ddPCR Supermix for Probes (No dUTP) | Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, USA | 1863024 | Supermix used in droplet generation |
| TaqMan MicroRNA Assays | Applied Biosystems, Inc., Foster City, CA, USA | 4440887 | Assays used in digital PCR (fluorescent hydrolysis probe) |
| hsa-miR-499 (750 RT/750 PCR rxns) | Applied Biosystems, Inc., Foster City, CA, USA | 4440887 | Assay Number 001352, commercial primers |
| cel-miR-39 (750 RT/750 PCR rxns) | Applied Biosystems, Inc., Foster City, CA, USA | 4440887 | Assay Number 000200, commercial primers |
| DG8 Cartridges and Gaskets | Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, USA | 1864007 | Cartridge takes up to 8 samples for droplet generation |
| DG8 Cartridge Holder | Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, USA | 1863051 | Holds cartridges in droplet generation |
| Droplet Generation Oil for Probes | Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, USA | 1863005 | Oil used in droplet generation |
| ddPCR 96-Well Plates | Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, USA | 12001925 | 96 well plate for ddPCR |
| PCR Plate Heat Seal, foil, pierceable | Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, USA | 1814040 | Pierceable foil, compatible with droplet reader |
| ddPCR Droplet Reader Oil | Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, USA | 1863004 | Oil used in droplet reading |
| QX100 or QX200 Droplet Generator | Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, USA | 1863002 | Droplet Generator, generates the droplets from sample/oil emulsion |
| PX1 PCR Plate Sealer | Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, USA | 1814000 | Seals the plate before PCR |
| C1000 Touch Thermal Cycler | Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, USA | 1851196 | Cycler used for ddPCR |
| QX100 or QX200 Droplet Reader | Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, USA | 1863003 | Reads PCR-positive and PCR-negative droplets with an optical detector |
| ddPCR Buffer Control for Probes | Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, USA | 1863052 | Blank control and to fill up the remaining wells of 8-well cassette |
| Software | |||
| QuantaSof Software | Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, USA | 1864011 | Program for droplet reading |
| Prism Windows 5 | GraphPad Software Inc., La Jolla, CA, USA | Program for statistical analysis |
Referenzen
- Schulte, C., Zeller, T. microRNA-based diagnostics and therapy in cardiovascular disease – summing up the facts. Cardiovascular Diagnosis and Therapy. 5, 17-36 (2015).
- Sun, T., et al. The role of microRNAs in myocardial infarction: from molecular mechanism to clinical application. International Journal of Molecular Sciences. 18, (2017).
- Dimmeler, S., Zeiher, A. M. Circulating microRNAs: novel biomarkers for cardiovascular diseases. European Heart Journal. 31, 2705-2707 (2010).
- Creemers, E. E., Tijsen, A. J., Pinto, Y. M. Circulating microRNAs: novel biomarkers and extracellular communicators in cardiovascular disease. Circulation Research. 110, 483-495 (2012).
- Oerlemans, M. I., et al. Early assessment of acute coronary syndromes in the emergency department: the potential diagnostic value of circulating microRNAs. EMBO Molecular Medicine. 4, 1176-1185 (2012).
- Olivieri, F., et al. Diagnostic potential of circulating miR-499-5p in elderly patients with acute non ST-elevation myocardial infarction. Internation Journal of Cardiology. 167, 531-536 (2013).
- Navickas, R., et al. Identifying circulating microRNAs as biomarkers of cardiovascular disease: a systematic review. Cardiovascular Research. 111, 322-337 (2016).
- Devaux, Y., et al. Diagnostic and prognostic value of circulating microRNAs in patients with acute chest pain. Journal of Internal Medicine. 277, 260-271 (2015).
- Schwarzenbach, H., da Silva, A. M., Calin, G., Pantel, K. Data normalization strategies for microRNA quantification. Clinical Chemistry. 61, 1333-1342 (2015).
- Hindson, B. J., et al. High-throughput droplet digital PCR system for absolute quantitation of DNA copy number. Analytical Chemistry. 83, 8604-8610 (2011).
- Hindson, C. M., et al. Absolute quantification by droplet digital PCR versus analog real-time PCR. Nature Methods. 10, 1003-1005 (2013).
- Robinson, S., et al. Droplet digital PCR as a novel detection method for quantifying microRNAs in acute myocardial infarction. Internation Journal of Cardiology. 257, 247-254 (2018).
- Mitchell, P. S., et al. Circulating microRNAs as stable blood-based markers for cancer detection. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. , 10513-10518 (2008).
- D’Alessandra, Y., et al. Circulating microRNAs are new and sensitive biomarkers of myocardial infarction. European Heart Journal. 31, 2765-2773 (2010).
- Forootan, A., et al. Methods to determine limit of detection and limit of quantification in quantitative real-time PCR (qPCR). Biomolecular Detection and Quantification. 12, 1-6 (2017).
- Dingle, T. C., Sedlak, R. H., Cook, L., Jerome, K. R. Tolerance of droplet-digital PCR vs real-time quantitative PCR to inhibitory substances. Clinical Chemistry. 59, 1670-1672 (2013).
- Taylor, S. C., Laperriere, G., Germain, H. Droplet digital PCR versus qPCR for gene expression analysis with low abundant targets: from variable nonsense to publication quality data. Scientific Reports. 7, 2409 (2017).
