Digital PCR para cuantificar la circulación MicroRNAs en infarto agudo de miocardio y enfermedades cardiovasculares
Summary
MicroRNAs circulación han demostrado promesa como biomarcadores para enfermedades cardiovasculares y los infartos agudos de miocardio. En este estudio, se describe un protocolo para la extracción de miRNA, transcripción inversa y PCR digital para la cuantificación absoluta de miRNAs en el suero de pacientes con enfermedad cardiovascular.
Abstract
Circulación del suero microRNAs (miRNAs) han demostrado promesa como biomarcadores para la enfermedad cardiovascular y el infarto agudo de miocardio (IAM), siendo liberado de las células cardiovasculares a la circulación. Circulación miRNAs son muy estables y pueden cuantificarse. La expresión cuantitativa de miRNAs específicos puede vincularse con la patología y algunos miRNAs Mostrar tejido alta y especificidad de la enfermedad. Búsqueda de nuevos biomarcadores de enfermedades cardiovasculares es de importancia para la investigación médica. Recientemente, se ha inventado la reacción en cadena de polimerasa digital (dPCR). dPCR, combinado con sondas de hidrólisis fluorescente, permite la cuantificación absoluta directa específica. dPCR exhibe cualidades técnicas superiores, incluyendo una baja variabilidad, alta linealidad y alta sensibilidad en comparación con la reacción en cadena de la polimerasa cuantitativa (qPCR). Así, la dPCR es un método más exacto y reproducible para cuantificar directamente el miRNAs, particularmente para el uso en grandes ensayos clínicos cardiovasculares múltiples centros. En esta publicación describimos cómo realizar efectivamente la PCR digital para evaluar el número de copia absoluta en muestras de suero.
Introduction
Circulación miRNAs se han identificado como marcadores promisorios para un número de enfermedades, incluyendo enfermedades cardiovasculares1. Los miRNAs son pequeñas, moléculas de ARN monocatenario no codificante (aproximadamente 22 nucleótidos de largo) están implicadas en la regulación postranscripcional mediante la alteración de la traducción del ARN mensajero y que influencia gene expression2, y son liberados a la circulación en los Estados fisiológicos y patológicos. La expresión cuantitativa de miRNAs específicos puede ser vinculada a la patología, y algunos miRNAs tejido alta y especificidad de la enfermedad1. En las enfermedades cardiovasculares, miRNAs se han convertido en candidatos atractivos como nuevos biomarcadores porque son notablemente estables en el suero y puede ser cuantificada con la ayuda de la metodología PCR3. El valor potencial de miRNAs como biomarcadores para infarto de miocardio ha sido evaluado en estudios pequeños, pero carece de una validación en cohortes grandes2. Por ejemplo, miR-499 se encuentra altamente expresada en el músculo miocardio, y se ha demostrado para ser aumentada significativamente en un AMI4,5,6. Además, regula programada muerte celular (apoptosis) y la diferenciación de los cardiomiocitos y así participa de varios mecanismos después de una IAM7. Aparte de algunos pequeños estudios reportando un valor incremental de miRNAs para el diagnóstico de IAM y superioridad, la superioridad o igualdad de troponinas cardiacas de alta sensibilidad no todavía ha probado en estudios de gran escala2,5 ,6,8. Más estudios prospectivos de cohortes grandes son, por lo tanto, necesarios para evaluar el valor potencial de diagnóstico de miRNAs. Además, métodos de cuantificación de miRNA necesitan ser optimizados y estandarizados usando comparables protocolos9. Ensayos estandarizados pueden reducir resultados inconsistentes y los miRNAs para convertirse en potenciales biomarcadores para el uso clínico rutinario, como biomarcadores deben ser cuantificados de una manera reproducible para asegurar su aplicabilidad clínica.
Recientemente, se ha introducido dPCR como un análisis de punto final. Divide la muestra en aproximadamente 20.000 reacciones individuales10. El sistema de dPCR entonces utiliza un Poisson estadístico análisis matemático de señales fluorescentes (reacciones positivas y negativas), lo que permite una cuantificación absoluta sin una curva estándar10. Cuando se combinan dPCR con sondas fluorescentes de hidrólisis, es posible la cuantificación absoluta directa altamente específica de miRNAs. Reacción en cadena de polimerasa digital ha demostrado exhibir cualidades técnicas superiores (incluyendo una variabilidad disminuida, una mayor reproducibilidad día a día, un alto grado de linealidad y una alta sensibilidad) para cuantificar los niveles de miRNA en el circulación en comparación con la PCR en tiempo real cuantitativa10,11. Estas cualidades técnicas superiores podrían ayudar a mitigar las limitaciones actuales en el uso de circulación miRNAs como biomarcadores y pueden conducir al establecimiento de miRNAs como biomarcadores en grandes ensayos clínicos cardiovasculares múltiples centros y como método de diagnóstico en general. En un estudio anterior, recientemente aplicada dPCR la cuantificación absoluta de miRNAs en pacientes con un IAM de circulación y fueron capaces de demostrar el potencial diagnóstico superior en comparación con la cuantificación de miRNAs por qPCR12.
En esta publicación, queremos demostrar que el uso de dPCR es un método preciso y reproducible para cuantificar directamente la circulación cardiovascular miRNAs. La cuantificación absoluta de miRNA niveles en suero, utilizando PCR digital, muestra potencial para el uso en grandes ensayos clínicos cardiovasculares múltiples centros. En esta publicación Describimos detalladamente cómo realizar con eficacia la PCR digital y cómo detectar el número de copia absoluto miRNA en suero.
Protocol
Representative Results
Discussion
PCR digital es un método relativamente novedoso punto final de la PCR que permite la cuantificación absoluta directa de ácidos nucleicos dentro de una muestra. El método posee ventajas particulares, incluyendo una variabilidad disminuida, una mayor reproducibilidad día a día y una sensibilidad superior11,12. Además, debido a la partición de la muestra en aproximadamente 20.000 solo reacciones y análisis de punto final, dPCR es más robusto a substancias …
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Los autores no tienen ninguna agradecimientos.
Materials
| RNA-Extraction | |||
| miRNeasy Serum/Plasma Kit (50) | Qiagen-Sample & Assay Technologies, Hilden, Deutschland | 217184 | Kit for microRNA extraction. Kit contains commercial buffer RWT (called number one in the manuscript) and RPE (called number two in manuscript). |
| miRNeasy Serum/Plasma Spike-in-Control; Syn-cel-miR-39 miRNA; 10pmol | Qiagen-Sample & Assay Technologies, Hilden, Deutschland | 219610 | Spike-in for normalisation , Sequence: 5'-UCACCGGGUGUAAAUCAGCUUG-3' |
| Reverse Transcription | |||
| TaqMan MicroRNA Reverse Transcription Kit (1000 Reactions) | Applied Biosystems, Inc., Foster City, CA, USA | 4366597 | Kit for microRNA reverse transcription |
| TaqMan MicroRNA Assays M | Applied Biosystems, Inc., Foster City, CA, USA | 4440887 | Assays used in reverse transcription |
| hsa-miR-499 (750 RT/750 PCR rxns) | Applied Biosystems, Inc., Foster City, CA, USA | 4440887 | Assay Number 001352 |
| cel-miR-39 (750 RT/750 PCR rxns) | Applied Biosystems, Inc., Foster City, CA, USA | 4440887 | Assay Number 000200 |
| PCR Plate, 96-well, segmented, semi-skirted | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA | AB0900 | 96 well plate for reverse transcription |
| Microseal ‘B’ seal Seals | Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, USA | MSB1001 | Foil to ensure proper storage |
| C1000 Touch Thermal Cycler | Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, USA | 1851196 | Cycler used for reverse transcription |
| Droplet Digital PCR | |||
| 100 nmole RNA oligo hsa-miR-499-5p | Integrated DNA Technologies | Custom | Sequence: 5'-phos-UUAAGACUUGCAGUGAUGUUU-3' |
| ddPCR Supermix for Probes (No dUTP) | Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, USA | 1863024 | Supermix used in droplet generation |
| TaqMan MicroRNA Assays | Applied Biosystems, Inc., Foster City, CA, USA | 4440887 | Assays used in digital PCR (fluorescent hydrolysis probe) |
| hsa-miR-499 (750 RT/750 PCR rxns) | Applied Biosystems, Inc., Foster City, CA, USA | 4440887 | Assay Number 001352, commercial primers |
| cel-miR-39 (750 RT/750 PCR rxns) | Applied Biosystems, Inc., Foster City, CA, USA | 4440887 | Assay Number 000200, commercial primers |
| DG8 Cartridges and Gaskets | Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, USA | 1864007 | Cartridge takes up to 8 samples for droplet generation |
| DG8 Cartridge Holder | Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, USA | 1863051 | Holds cartridges in droplet generation |
| Droplet Generation Oil for Probes | Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, USA | 1863005 | Oil used in droplet generation |
| ddPCR 96-Well Plates | Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, USA | 12001925 | 96 well plate for ddPCR |
| PCR Plate Heat Seal, foil, pierceable | Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, USA | 1814040 | Pierceable foil, compatible with droplet reader |
| ddPCR Droplet Reader Oil | Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, USA | 1863004 | Oil used in droplet reading |
| QX100 or QX200 Droplet Generator | Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, USA | 1863002 | Droplet Generator, generates the droplets from sample/oil emulsion |
| PX1 PCR Plate Sealer | Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, USA | 1814000 | Seals the plate before PCR |
| C1000 Touch Thermal Cycler | Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, USA | 1851196 | Cycler used for ddPCR |
| QX100 or QX200 Droplet Reader | Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, USA | 1863003 | Reads PCR-positive and PCR-negative droplets with an optical detector |
| ddPCR Buffer Control for Probes | Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, USA | 1863052 | Blank control and to fill up the remaining wells of 8-well cassette |
| Software | |||
| QuantaSof Software | Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, USA | 1864011 | Program for droplet reading |
| Prism Windows 5 | GraphPad Software Inc., La Jolla, CA, USA | Program for statistical analysis |
Referenzen
- Schulte, C., Zeller, T. microRNA-based diagnostics and therapy in cardiovascular disease – summing up the facts. Cardiovascular Diagnosis and Therapy. 5, 17-36 (2015).
- Sun, T., et al. The role of microRNAs in myocardial infarction: from molecular mechanism to clinical application. International Journal of Molecular Sciences. 18, (2017).
- Dimmeler, S., Zeiher, A. M. Circulating microRNAs: novel biomarkers for cardiovascular diseases. European Heart Journal. 31, 2705-2707 (2010).
- Creemers, E. E., Tijsen, A. J., Pinto, Y. M. Circulating microRNAs: novel biomarkers and extracellular communicators in cardiovascular disease. Circulation Research. 110, 483-495 (2012).
- Oerlemans, M. I., et al. Early assessment of acute coronary syndromes in the emergency department: the potential diagnostic value of circulating microRNAs. EMBO Molecular Medicine. 4, 1176-1185 (2012).
- Olivieri, F., et al. Diagnostic potential of circulating miR-499-5p in elderly patients with acute non ST-elevation myocardial infarction. Internation Journal of Cardiology. 167, 531-536 (2013).
- Navickas, R., et al. Identifying circulating microRNAs as biomarkers of cardiovascular disease: a systematic review. Cardiovascular Research. 111, 322-337 (2016).
- Devaux, Y., et al. Diagnostic and prognostic value of circulating microRNAs in patients with acute chest pain. Journal of Internal Medicine. 277, 260-271 (2015).
- Schwarzenbach, H., da Silva, A. M., Calin, G., Pantel, K. Data normalization strategies for microRNA quantification. Clinical Chemistry. 61, 1333-1342 (2015).
- Hindson, B. J., et al. High-throughput droplet digital PCR system for absolute quantitation of DNA copy number. Analytical Chemistry. 83, 8604-8610 (2011).
- Hindson, C. M., et al. Absolute quantification by droplet digital PCR versus analog real-time PCR. Nature Methods. 10, 1003-1005 (2013).
- Robinson, S., et al. Droplet digital PCR as a novel detection method for quantifying microRNAs in acute myocardial infarction. Internation Journal of Cardiology. 257, 247-254 (2018).
- Mitchell, P. S., et al. Circulating microRNAs as stable blood-based markers for cancer detection. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. , 10513-10518 (2008).
- D’Alessandra, Y., et al. Circulating microRNAs are new and sensitive biomarkers of myocardial infarction. European Heart Journal. 31, 2765-2773 (2010).
- Forootan, A., et al. Methods to determine limit of detection and limit of quantification in quantitative real-time PCR (qPCR). Biomolecular Detection and Quantification. 12, 1-6 (2017).
- Dingle, T. C., Sedlak, R. H., Cook, L., Jerome, K. R. Tolerance of droplet-digital PCR vs real-time quantitative PCR to inhibitory substances. Clinical Chemistry. 59, 1670-1672 (2013).
- Taylor, S. C., Laperriere, G., Germain, H. Droplet digital PCR versus qPCR for gene expression analysis with low abundant targets: from variable nonsense to publication quality data. Scientific Reports. 7, 2409 (2017).
