急性心筋梗塞と心血管疾患のマイクロ Rna を循環の定量化デジタル PCR
Summary
循環のマイクロ Rna は、心血管疾患および急性心筋梗塞のバイオ マーカーとして約束を示しています。本研究ではマイクロ Rna の抽出、逆のトランスクリプションおよび心血管疾患患者の血清中の miRNAs の絶対的な定量化のためデジタル PCR のためのプロトコルについて述べる。
Abstract
循環血中マイクロ Rna (Mirna) は、循環に心血管系の細胞から放出される心血管疾患および急性心筋梗塞 (AMI) のバイオ マーカーとしての約束を示しています。循環の miRNAs は非常に安定した、定量化することができます。特定の miRNAs の定量化は、病理学といくつかの miRNAs ショー高組織および疾患特異性にリンクできます。心血管疾患の新規バイオ マーカーを見つけることは医学研究のための重要です。ごく最近、デジタルのポリメラーゼの連鎖反応 (dPCR) が発明されています。dPCR、加水分解蛍光プローブと組み合わせて特定の直接絶対定量ができます。dPCR は、変動の少ない、高直線性の量的なポリメラーゼの連鎖反応 (qPCR) に比べて感度が高いなど、優れた技術的な資質を展示します。したがって、dPCR は、特に大規模な多施設循環器臨床試験で使用するための Mirna を直接定量化のより正確で再現性のある方法です。この文書では血清中絶対コピー数を把握するためにデジタル PCR を効果的に実行する方法をについて説明します。
Introduction
循環の miRNAs は、疾患、心血管疾患の1を含む数の有望なマーカーとして識別されています。Mirna が小さい、単一座礁させた RNA 分子の非コーディング (約 22 ヌクレオチド長い) が関与している、転写後調節を介してメッセンジャー RNA の翻訳および影響を及ぼす遺伝子表現2の変化され、生理学的および病理学的状態の循環に解放されます。特定の miRNAs の定量的表現は、病理学にリンクすることし、いくつかの miRNAs 示し高組織疾患特異性1。心血管疾患における Mirna PCR 方法論3の助けを借りて定量化する新規バイオ マーカーが血清で非常に安定して、簡単にすることができますので、魅力的な候補となっています。小規模の研究で心筋梗塞のバイオ マーカーとしての miRNAs の潜在的な価値を評価が大規模なコホートで検証、2を欠けています。たとえば、ミール 499 は心筋の筋肉において高い発現があるし、亜美4,5,6で大幅に増加することが示されています。さらに、それを調節するプログラムされた細胞死 (アポトーシス) 心筋細胞の分化と従って次亜美7いくつかのメカニズムに関与しています。別にいくつかの小さな研究優位性と AMI の診断のための Mirna の増分値を報告、高感度心臓 troponins に優位性等はまだ証明されていない大規模な研究2,5 ,6,8。大規模なコホートでより多くの前向き研究は、したがって、miRNAs の潜在的な診断価値を評価するために必要。さらに、マイクロ Rna 定量法の最適化が必要な9のプロトコル標準化された同等を使用しています。標準化されたアッセイは、一貫性のない結果が減り、バイオ マーカーが臨床適用性を確保するため再現性のある方法で定量化する必要がある潜在的なバイオ マーカーのルーチンの臨床応用を目指しての Mirna が役立つことがあります。
最近では、dPCR は、エンドポイント分析として導入されています。それは約 20,000 の個々 の反作用10にサンプルをパーティション分割します。DPCR システムは、数学的なポアソンの統計的分析蛍光信号 (正と負の反応)、標準曲線10なし絶対定量を有効にするを利用します。加水分解蛍光プローブと dPCR を組み合わせて、miRNAs の非常に特定の直接の絶対定量が可能です。MiRNA のレベルを定量化するための優れた技術的な資質 (減少の変動、増加の日常的な再現性、高い直線性、高感度など) を展示するデジタル ポリメラーゼの連鎖反応を示しました、定量的リアルタイム PCR10,11と比較して循環。これらの優れた技術的な資質のバイオ マーカーとして循環の miRNAs の使用上の現在の制限を軽減するために役立つかもしれないし、大規模な多施設循環器臨床試験におけるバイオ マーカーと診断法として、miRNAs の確立につながる可能性があります。一般的です。以前の研究では、最近、AMI 患者の miRNAs の循環の絶対的な定量化のための dPCR を適用し、qPCR12の miRNAs の定量化と比較して優れた診断能力を発揮することができた。
この文書の dPCR を使用してが直接心血管の miRNAs の循環の定量化の正確かつ再現性のある方法であることを実証したいです。デジタル PCR を用いる血清中マイクロ Rna レベルの絶対定量は、大規模なマルチ センター心臓血管臨床試験で使用するため潜在的なを示しています。この文書で述べるデジタル PCR を効果的に実行する方法、および血清の miRNA 絶対コピー数を検出する方法。
Protocol
Representative Results
Discussion
デジタル PCR は比較的新規エンドポイントにより、核酸サンプル内の直接の絶対定量 PCR 法であります。メソッドでは、減少の変動、高められた日常の再現性、優れた感度11,12など、特定の利点を所有しています。さらに、サンプルは約 20,000 の単一反応やエンドポイント分析に分配による dPCR は堅牢に定量的 RT-PCR 法16と比較して P…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
著者の謝辞があります。
Materials
| RNA-Extraction | |||
| miRNeasy Serum/Plasma Kit (50) | Qiagen-Sample & Assay Technologies, Hilden, Deutschland | 217184 | Kit for microRNA extraction. Kit contains commercial buffer RWT (called number one in the manuscript) and RPE (called number two in manuscript). |
| miRNeasy Serum/Plasma Spike-in-Control; Syn-cel-miR-39 miRNA; 10pmol | Qiagen-Sample & Assay Technologies, Hilden, Deutschland | 219610 | Spike-in for normalisation , Sequence: 5'-UCACCGGGUGUAAAUCAGCUUG-3' |
| Reverse Transcription | |||
| TaqMan MicroRNA Reverse Transcription Kit (1000 Reactions) | Applied Biosystems, Inc., Foster City, CA, USA | 4366597 | Kit for microRNA reverse transcription |
| TaqMan MicroRNA Assays M | Applied Biosystems, Inc., Foster City, CA, USA | 4440887 | Assays used in reverse transcription |
| hsa-miR-499 (750 RT/750 PCR rxns) | Applied Biosystems, Inc., Foster City, CA, USA | 4440887 | Assay Number 001352 |
| cel-miR-39 (750 RT/750 PCR rxns) | Applied Biosystems, Inc., Foster City, CA, USA | 4440887 | Assay Number 000200 |
| PCR Plate, 96-well, segmented, semi-skirted | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA | AB0900 | 96 well plate for reverse transcription |
| Microseal ‘B’ seal Seals | Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, USA | MSB1001 | Foil to ensure proper storage |
| C1000 Touch Thermal Cycler | Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, USA | 1851196 | Cycler used for reverse transcription |
| Droplet Digital PCR | |||
| 100 nmole RNA oligo hsa-miR-499-5p | Integrated DNA Technologies | Custom | Sequence: 5'-phos-UUAAGACUUGCAGUGAUGUUU-3' |
| ddPCR Supermix for Probes (No dUTP) | Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, USA | 1863024 | Supermix used in droplet generation |
| TaqMan MicroRNA Assays | Applied Biosystems, Inc., Foster City, CA, USA | 4440887 | Assays used in digital PCR (fluorescent hydrolysis probe) |
| hsa-miR-499 (750 RT/750 PCR rxns) | Applied Biosystems, Inc., Foster City, CA, USA | 4440887 | Assay Number 001352, commercial primers |
| cel-miR-39 (750 RT/750 PCR rxns) | Applied Biosystems, Inc., Foster City, CA, USA | 4440887 | Assay Number 000200, commercial primers |
| DG8 Cartridges and Gaskets | Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, USA | 1864007 | Cartridge takes up to 8 samples for droplet generation |
| DG8 Cartridge Holder | Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, USA | 1863051 | Holds cartridges in droplet generation |
| Droplet Generation Oil for Probes | Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, USA | 1863005 | Oil used in droplet generation |
| ddPCR 96-Well Plates | Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, USA | 12001925 | 96 well plate for ddPCR |
| PCR Plate Heat Seal, foil, pierceable | Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, USA | 1814040 | Pierceable foil, compatible with droplet reader |
| ddPCR Droplet Reader Oil | Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, USA | 1863004 | Oil used in droplet reading |
| QX100 or QX200 Droplet Generator | Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, USA | 1863002 | Droplet Generator, generates the droplets from sample/oil emulsion |
| PX1 PCR Plate Sealer | Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, USA | 1814000 | Seals the plate before PCR |
| C1000 Touch Thermal Cycler | Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, USA | 1851196 | Cycler used for ddPCR |
| QX100 or QX200 Droplet Reader | Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, USA | 1863003 | Reads PCR-positive and PCR-negative droplets with an optical detector |
| ddPCR Buffer Control for Probes | Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, USA | 1863052 | Blank control and to fill up the remaining wells of 8-well cassette |
| Software | |||
| QuantaSof Software | Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, USA | 1864011 | Program for droplet reading |
| Prism Windows 5 | GraphPad Software Inc., La Jolla, CA, USA | Program for statistical analysis |
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