Digitale PCR zur Quantifizierung der zirkulierenden MicroRNAs in akuten Myokardinfarkt und kardiovaskulären Erkrankungen

Summary

Zirkulierenden MicroRNAs haben Versprechen als Biomarker für kardiovaskuläre Erkrankungen und akute Myokardinfarkte gezeigt. In dieser Studie beschreiben wir ein Protokoll für die MiRNA-Extraktion, reverse Transkription und digitale PCR für die absolute Quantifizierung von MiRNAs im Serum von Patienten mit kardiovaskulären Erkrankungen.

Abstract

Zirkulierende Serum Mikro-RNAs (MiRNAs) haben gezeigt, dass Versprechen als Biomarker für die Herz-Kreislauf-Krankheiten und akutem Myokardinfarkt (AMI), wird von den Herz-Kreislauf-Zellen in den Blutkreislauf freigesetzt. Zirkulierenden MiRNAs sind sehr stabil und quantifiziert werden kann. Quantitative Ausdruck der spezifischen MiRNAs kann mit der Pathologie und einige MiRNAs zeigen hohe Gewebe und Krankheit Spezifität verknüpft werden. Neue Biomarker für Herz-Kreislauf-Krankheiten zu finden ist von Bedeutung für die medizinische Forschung. Vor kurzem wurde digital Polymerase-Kettenreaktion (dPCR) erfunden. dPCR, kombiniert mit fluoreszierenden Hydrolyse Sonden ermöglicht eine spezifische direkte absolute Quantifizierung. dPCR stellt überlegene technische Eigenschaften, einschließlich eine geringe Variabilität, hohe Linearität und hohe Empfindlichkeit im Vergleich zu den quantitativen Polymerase-Kettenreaktion (qPCR). Somit ist dPCR eine genaue und reproduzierbare Methode zur Quantifizierung der MiRNAs, speziell für den Einsatz in großen multizentrischen klinischen Herz-Kreislauf-direkt. In dieser Publikation beschreiben wir, wie effektiv digitale PCR durchzuführen, um die absolute Kopienzahl in Serumproben zu beurteilen.

Introduction

Zirkulierenden MiRNAs wurden als vielversprechender Marker für eine Reihe von Krankheiten, einschließlich Herz-Kreislauf-Krankheit¹identifiziert. Die MiRNAs sind klein, nicht-kodierenden einsträngige RNA-Moleküle (ca. 22 Nukleotide lang) engagieren sich in der Posttranskriptionale Verordnung über die Änderung der Boten-RNA Übersetzung und beeinflussende Gene Expression², und in den Blutkreislauf in physiologischen und pathologischen Zuständen freigegeben werden. Quantitative Ausdruck der spezifischen MiRNAs der Pathologie zugeordnet werden kann, und einige MiRNAs zeigen hohe Gewebe und Krankheit Spezifität¹. Im Herz-Kreislauf-Krankheiten sind MiRNAs attraktive Kandidaten geworden, da neue Biomarker weil sie bemerkenswert stabil im Serum sind und leicht können mit Hilfe der PCR Methode³quantifiziert werden. Der potenzielle Wert der MiRNAs als Biomarker für Myokardinfarkt wurde in kleinen Studien ausgewertet, aber eine Validierung in großen Kohorten fehlt². Zum Beispiel MiR-499 findet man hoch in den Herzmuskel zum Ausdruck gebracht, und es hat gezeigt, dass ein AMI^4,5,6deutlich erhöht werden. Darüber hinaus regelt es programmierte Zelltod (Apoptose) und die Differenzierung von Kardiomyozyten und engagiert sich daher in mehrere Mechanismen, die nach einem AMI-⁷. Abgesehen von einigen kleinen Studien Berichterstattung eine Überlegenheit und inkrementellen Wert von MiRNAs für die Diagnose von AMI Überlegenheit oder Gleichheit zu hoher Empfindlichkeit kardiale Troponins nicht noch in groß angelegten Studien^{2,5 nachweislich ,6,8}. Weitere prospektiven Studien in großen Kohorten sind daher erforderlich, um die mögliche diagnostische Wertigkeit von MiRNAs zu beurteilen. Darüber hinaus Methoden zur Quantifizierung der MiRNA optimiert werden müssen und standardisierte Verwendung vergleichbarer Protokolle⁹. Standardisierte Tests möglicherweise inkonsistente Ergebnisse reduzieren und können helfen MiRNAs, potenzielle Biomarker für die routinemäßige klinische Anwendung werden als Biomarker müssen reproduzierbar Sicherstellung ihrer klinischen Anwendbarkeit quantifiziert werden.

Vor kurzem, hat dPCR als eine Endpunktanalyse eingeführt. Es Partitionen die Probe in etwa 20.000 individuelle Reaktionen¹⁰. Das dPCR System nutzt dann eine mathematische Poisson statistische fluoreszierende Signale (positive und negative Reaktionen), wodurch eine absolute Quantifizierung ohne eine Standardkurve¹⁰. Bei der Kombination von dPCR mit fluoreszierenden Hydrolyse Sonden wird die hochspezifische direkte absolute Quantifizierung von MiRNAs ermöglicht. Digitalen Polymerase-Kettenreaktion hat gezeigt, dass überlegene technische Eigenschaften (einschließlich eine verminderte Variabilität, einer erhöhten täglichen Reproduzierbarkeit, ein hohes Maß an Linearität und eine hohe Empfindlichkeit) zur Quantifizierung der MiRNA-Ebenen in weisen die Zirkulation im Vergleich zu quantitative Echtzeit-PCR-^10,11. Diese überlegene technische Qualitäten könnte dazu beitragen, um aktuelle Beschränkungen bei der Verwendung von zirkulierenden MiRNAs als Biomarker zu mildern und führen zur Gründung der MiRNAs als Biomarker in großen multizentrischen klinischen Herz-Kreislauf- sowie eine diagnostische Methode in allgemeine. In einer früheren Studie haben wir vor kurzem angewendet dPCR für die absolute Quantifizierung der zirkulierenden MiRNAs bei Patienten mit einem AMI und konnten überlegene diagnostische Potenzial im Vergleich zu der Quantifizierung von MiRNAs qPCR¹²zeigen.

In dieser Publikation wollen wir zeigen, dass mit dPCR ist eine genaue und reproduzierbare Methode zur Quantifizierung der zirkulierenden Herz-Kreislauf-MiRNAs direkt. Die absolute Quantifizierung der MiRNA-Niveaus im Serum, mit digitalen PCR zeigt Potenzial für den Einsatz in großen multizentrischen Herz-Kreislauf-klinische Studien. In dieser Publikation beschreiben wir ausführlich, wie Sie digitale PCR effizient zu erfüllen und um die absolute MiRNA Kopienzahl im Serum zu erkennen.

Protocol

1. Gewinnung von MiRNA aus Plasma/Serum Hinweis: Um MiRNAs angemessen zu quantifizieren, die richtige MicroRNA-Isolierung aus dem Plasma/Serum ist ein entscheidender Schritt. Eine wichtige Sache zu beachten, vor allem, weil unterschiedliche Protokolle vorhanden sind, ist zur Einhaltung des gleichen Workflows bei der Verarbeitung der Proben. In diesem Protokoll wird MiRNA aus 50 µL Serum gewonnen. Verwenden Sie nicht mehr als 200 µL als dieser Grenzwert die korrekte Extraktion. Bere…

Representative Results

Digitale PCR kombiniert mit fluoreszierenden Hydrolyse Sonden ermöglicht Forschern direkt die absoluten Beträge der spezifischen MiRNAs in Kopien/µL zu quantifizieren. Wie das Beispiel in dPCR in etwa 20.000 einzelnen PCR-Reaktionen, partitioniert ist dPCR erfordert keine technischen repliziert10. Das dPCR System nutzt eine mathematische Poisson statistische Analyse der fluoreszierenden Signale (die sich zwischen positiven und negativen Reaktionen) eine absolute…

Discussion

Digitale PCR ist ein relativ neuer Endpunkt-Methode von PCR, die die direkte absolute Quantifizierung von Nukleinsäuren innerhalb einer Probe ermöglicht. Die Methode besitzt bestimmte Vorteile, wie eine verminderte Variabilität, einer erhöhten täglichen Reproduzierbarkeit und eine höhere Sensitivität^11,12. Darüber hinaus durch die Partitionierung der Probe in etwa 20.000 einzelne Reaktionen und Endpunkt Analysen dPCR ist robuster, störender Substanzen in…

Materials

RNA-Extraction
miRNeasy Serum/Plasma Kit (50)	Qiagen-Sample & Assay Technologies, Hilden, Deutschland	217184	Kit for microRNA extraction. Kit contains commercial buffer RWT (called number one in the manuscript)  and RPE (called number two in manuscript).
miRNeasy Serum/Plasma Spike-in-Control; Syn-cel-miR-39 miRNA; 10pmol	Qiagen-Sample & Assay Technologies, Hilden, Deutschland	219610	Spike-in for normalisation , Sequence: 5'-UCACCGGGUGUAAAUCAGCUUG-3'
Reverse Transcription
TaqMan MicroRNA Reverse Transcription Kit (1000 Reactions)	Applied Biosystems, Inc., Foster City, CA, USA	4366597	Kit for microRNA reverse transcription
TaqMan MicroRNA Assays M	Applied Biosystems, Inc., Foster City, CA, USA	4440887	Assays used in reverse transcription
hsa-miR-499 (750 RT/750 PCR rxns)	Applied Biosystems, Inc., Foster City, CA, USA	4440887	Assay Number 001352
cel-miR-39 (750 RT/750 PCR rxns)	Applied Biosystems, Inc., Foster City, CA, USA	4440887	Assay Number 000200
PCR Plate, 96-well, segmented, semi-skirted	Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA	AB0900	96 well plate for reverse transcription
Microseal ‘B’ seal Seals	Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, USA	MSB1001	Foil to ensure proper storage
C1000 Touch Thermal Cycler	Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, USA	1851196	Cycler used for reverse transcription
Droplet Digital PCR
100 nmole RNA oligo hsa-miR-499-5p	Integrated DNA Technologies	Custom	Sequence: 5'-phos-UUAAGACUUGCAGUGAUGUUU-3'
ddPCR Supermix for Probes (No dUTP)	Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, USA	1863024	Supermix used in droplet generation
TaqMan MicroRNA Assays	Applied Biosystems, Inc., Foster City, CA, USA	4440887	Assays used in digital PCR (fluorescent hydrolysis probe)
hsa-miR-499 (750 RT/750 PCR rxns)	Applied Biosystems, Inc., Foster City, CA, USA	4440887	Assay Number 001352, commercial primers
cel-miR-39 (750 RT/750 PCR rxns)	Applied Biosystems, Inc., Foster City, CA, USA	4440887	Assay Number 000200, commercial primers
DG8 Cartridges and Gaskets	Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, USA	1864007	Cartridge takes up to 8 samples for droplet generation
DG8 Cartridge Holder	Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, USA	1863051	Holds cartridges in droplet generation
Droplet Generation Oil for Probes	Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, USA	1863005	Oil used in droplet generation
ddPCR 96-Well Plates	Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, USA	12001925	96 well plate for ddPCR
PCR Plate Heat Seal, foil, pierceable	Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, USA	1814040	Pierceable foil, compatible with droplet reader
ddPCR Droplet Reader Oil	Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, USA	1863004	Oil used in droplet reading
QX100 or QX200 Droplet Generator	Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, USA	1863002	Droplet Generator, generates the droplets from sample/oil emulsion
PX1 PCR Plate Sealer	Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, USA	1814000	Seals the plate before PCR
C1000 Touch Thermal Cycler	Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, USA	1851196	Cycler used for ddPCR
QX100 or QX200 Droplet Reader	Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, USA	1863003	Reads PCR-positive and PCR-negative droplets with an optical detector
ddPCR Buffer Control for Probes	Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, USA	1863052	Blank control and to fill up the remaining wells of 8-well cassette
Software
QuantaSof Software	Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, USA	1864011	Program for droplet reading
Prism Windows 5	GraphPad Software Inc., La Jolla, CA, USA		Program for statistical analysis