بكر الرقمية للتحديد الكمي لتعميم MicroRNAs في احتشاء عضلة القلب الحاد وأمراض القلب والأوعية الدموية
Summary
وقد أظهرت ميكرورناس تعميم الوعد المؤشرات الحيوية لأمراض القلب والأوعية الدموية وقال عضلة القلب الحاد. في هذه الدراسة، يمكننا وصف بروتوكول لاستخراج ميرنا والنسخ العكسي، وبكر الرقمية للتحديد الكمي المطلق ميرناس في مصل المرضى الذين يعانون من أمراض القلب والأوعية الدموية.
Abstract
تعميم المصل ميكرورناس (ميرناس) قد أظهرت الوعد كالمؤشرات الحيوية لأمراض القلب والأوعية الدموية واحتشاء عضلة القلب الحاد (عامي)، الإفراج عنهم من خلايا القلب والأوعية الدموية في الدورة الدموية. ميرناس المتداولة هي مستقرة جداً ويمكن قياسها كمياً. ويمكن ربط التعبير الكمي عن ميرناس محددة لعلم الأمراض، وبعض ميرناس وتظهر الأنسجة عالية وخصوصية المرض. إيجاد رواية المؤشرات الحيوية لأمراض القلب والأوعية الدموية من الأهمية للبحوث الطبية. ومؤخرا جداً، تم اختراع الرقمية البلمرة المتسلسل (دبكر). دبكر، جنبا إلى جنب مع تحقيقات التحلل الفلورسنت، تمكن الكمي المطلق مباشرة محددة. دبكر المعارض متفوقة الصفات التقنية، بما في ذلك تقلب منخفضة وعالية الخطي، وحساسية عالية مقارنة بالكمية البلمرة المتسلسل (قبكر). وهكذا، دبكر أسلوب أكثر دقة واستنساخه للتحديد الكمي لمباشرة ميرناس، خاصة للاستخدام في التجارب السريرية القلبية الوعائية مركز متعدد كبيرة. في هذا المنشور، ونحن تصف كيفية فعالية أداء بكر الرقمية بغية تقييم عدد النسخ المطلق في عينات مصل الدم.
Introduction
وقد حددت ميرناس المتداولة كعلامات تبشر بالخير لعدد من الأمراض، بما في ذلك أمراض القلب والأوعية الدموية1. ميرناس الصغيرة، وغير الترميز جزيئات الحمض النووي الريبي واحد-الذين تقطعت بهم السبل (حوالي 22 النيوكليوتيدات طويلة) وتشارك في التنظيم بوستترانسكريبشونال عن طريق تحوير الحمض النووي الريبي رسول الترجمة والتأثير على التعبير الجيني2، ويتم إصدارها للتداول في الدول الفسيولوجية والمرضية على حد سواء. التعبير الكمي عن ميرناس معينة يمكن ربطها علم الأمراض، وبعض ميرناس وتظهر الأنسجة عالية و خصوصية المرض1. في أمراض القلب والأوعية الدموية، أصبحت ميرناس جاذبية المرشحين حسب المؤشرات الحيوية رواية كمياً لأنهم استقرارا ملحوظا في المصل ويمكن بسهولة مع المساعدة من منهجية بكر3. وقد تم تقييم القيمة المحتملة ميرناس كالمؤشرات الحيوية لاحتشاء عضلة القلب في دراسات صغيرة، ولكن التحقق من صحة في أفواج كبيرة تفتقر إلى2. على سبيل المثال، يوجد مير-499 أعرب شديدة في عضلة عضلة القلب، وقد ثبت أن تحقيق زيادة كبيرة في أمي4،،من56. علاوة على ذلك، فإنه ينظم برمجة موت الخلايا (المبرمج) والتفريق بين كارديوميوسيتيس وهكذا تشارك في العديد من الآليات التالية عامي7. وبصرف النظر عن بعض الدراسات الصغيرة الإبلاغ التفوق والقيمة الإضافية ميرناس لتشخيص أمي، بالتفوق أو المساواة بحساسية عالية تروبونينس القلب لا بعد ثبت في دراسات واسعة النطاق2،5 ،،من68. ولذلك، المزيد من الدراسات المستقبلية في أفواج كبيرة ضرورية لتقييم قيمة التشخيص المحتملة ميرناس. بالإضافة إلى ذلك، أساليب القياس الكمي ميرنا بحاجة إلى أن يكون الأمثل وموحدة باستخدام المقارنة بروتوكولات9. الاختبارات الموحدة قد يقلل من نتائج غير متناسقة وقد تساعد ميرناس لتصبح المؤشرات الحيوية المحتملة للتطبيق السريري الروتيني، كما تحتاج المؤشرات الحيوية كمياً بطريقة استنساخه لضمان قابليتها للتطبيق السريري.
وقد أدخلت مؤخرا، دبكر كتحليل نقطة نهاية. الأقسام العينة إلى ردود الفعل الفردية 20,000 حوالي الساعة10. ثم يستخدم النظام دبكر رياضية Poisson تحليلاً إحصائيا لإشارات الفلورسنت (ردود الفعل الإيجابية والسلبية)، تمكن القياس الكمي مطلق دون منحنى المعياري10. عند الجمع بين دبكر مع تحقيقات التحلل الفلورسنت، أصبح ممكناً التقدير الكمي المطلق مباشرة محددة للغاية من ميرناس. أظهرت الرقمية تفاعل البوليميراز المتسلسل يحمل الصفات التقنية العليا (بما في ذلك تقلب انخفاض، زيادة في إمكانية تكرار نتائج اليومية ودرجة عالية من الخطي وحساسية عالية) لقياس مستويات ميرنا في تداول مقارنة بالكمية في الوقت الحقيقي بكر10،11. هذه الصفات التقنية المتفوقة قد يساعد على التخفيف من القيود المفروضة حاليا على استخدام ميرناس المتداولة كالمؤشرات الحيوية، وقد يؤدي إلى إنشاء ميرناس كالمؤشرات الحيوية في التجارب السريرية القلبية الوعائية مركز متعدد كبيرة وأسلوب تشخيص في العامة. في دراسة سابقة، ونحن مؤخرا تطبيق دبكر للتحديد الكمي المطلق لتعميم ميرناس في المرضى الذين يعانون من أمي وكانت قادرة على إثبات إمكانية التشخيص متفوقة مقارنة بالتحديد الكمي ميرناس قبكر12.
في هذا المنشور، نريد أن ندلل على أن استخدام دبكر طريقة دقيقة واستنساخه للتحديد الكمي لمباشرة تعميم ميرناس القلب والأوعية الدموية. التحديد الكمي المطلق لمستويات ميرنا في مصل الدم، استخدام PCR الرقمية، يظهر المحتملة للاستخدام كبير مركز متعدد التجارب السريرية القلب والأوعية الدموية. في هذا المنشور، ونحن تصف بالتفصيل كيفية تنفيذ فعالية PCR الرقمية وكيفية الكشف عن عدد نسخ ميرنا المطلق في مصل الدم.
Protocol
Representative Results
Discussion
بكر الرقمية هو أسلوب نقطة نهاية جديدة نسبيا من PCR الذي يسمح التحديد الكمي المطلق مباشرة من الأحماض النووية داخل عينة. الأسلوب الذي يملك مزايا خاصة، بما في ذلك تقلب انخفاض، زيادة في إمكانية تكرار نتائج اليومية، و حساسية فائقة11،12. علاوة على ذلك، بسبب تقسيم ال?…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
المؤلفين قد لا إعلامات.
Materials
| RNA-Extraction | |||
| miRNeasy Serum/Plasma Kit (50) | Qiagen-Sample & Assay Technologies, Hilden, Deutschland | 217184 | Kit for microRNA extraction. Kit contains commercial buffer RWT (called number one in the manuscript) and RPE (called number two in manuscript). |
| miRNeasy Serum/Plasma Spike-in-Control; Syn-cel-miR-39 miRNA; 10pmol | Qiagen-Sample & Assay Technologies, Hilden, Deutschland | 219610 | Spike-in for normalisation , Sequence: 5'-UCACCGGGUGUAAAUCAGCUUG-3' |
| Reverse Transcription | |||
| TaqMan MicroRNA Reverse Transcription Kit (1000 Reactions) | Applied Biosystems, Inc., Foster City, CA, USA | 4366597 | Kit for microRNA reverse transcription |
| TaqMan MicroRNA Assays M | Applied Biosystems, Inc., Foster City, CA, USA | 4440887 | Assays used in reverse transcription |
| hsa-miR-499 (750 RT/750 PCR rxns) | Applied Biosystems, Inc., Foster City, CA, USA | 4440887 | Assay Number 001352 |
| cel-miR-39 (750 RT/750 PCR rxns) | Applied Biosystems, Inc., Foster City, CA, USA | 4440887 | Assay Number 000200 |
| PCR Plate, 96-well, segmented, semi-skirted | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA | AB0900 | 96 well plate for reverse transcription |
| Microseal ‘B’ seal Seals | Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, USA | MSB1001 | Foil to ensure proper storage |
| C1000 Touch Thermal Cycler | Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, USA | 1851196 | Cycler used for reverse transcription |
| Droplet Digital PCR | |||
| 100 nmole RNA oligo hsa-miR-499-5p | Integrated DNA Technologies | Custom | Sequence: 5'-phos-UUAAGACUUGCAGUGAUGUUU-3' |
| ddPCR Supermix for Probes (No dUTP) | Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, USA | 1863024 | Supermix used in droplet generation |
| TaqMan MicroRNA Assays | Applied Biosystems, Inc., Foster City, CA, USA | 4440887 | Assays used in digital PCR (fluorescent hydrolysis probe) |
| hsa-miR-499 (750 RT/750 PCR rxns) | Applied Biosystems, Inc., Foster City, CA, USA | 4440887 | Assay Number 001352, commercial primers |
| cel-miR-39 (750 RT/750 PCR rxns) | Applied Biosystems, Inc., Foster City, CA, USA | 4440887 | Assay Number 000200, commercial primers |
| DG8 Cartridges and Gaskets | Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, USA | 1864007 | Cartridge takes up to 8 samples for droplet generation |
| DG8 Cartridge Holder | Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, USA | 1863051 | Holds cartridges in droplet generation |
| Droplet Generation Oil for Probes | Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, USA | 1863005 | Oil used in droplet generation |
| ddPCR 96-Well Plates | Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, USA | 12001925 | 96 well plate for ddPCR |
| PCR Plate Heat Seal, foil, pierceable | Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, USA | 1814040 | Pierceable foil, compatible with droplet reader |
| ddPCR Droplet Reader Oil | Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, USA | 1863004 | Oil used in droplet reading |
| QX100 or QX200 Droplet Generator | Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, USA | 1863002 | Droplet Generator, generates the droplets from sample/oil emulsion |
| PX1 PCR Plate Sealer | Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, USA | 1814000 | Seals the plate before PCR |
| C1000 Touch Thermal Cycler | Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, USA | 1851196 | Cycler used for ddPCR |
| QX100 or QX200 Droplet Reader | Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, USA | 1863003 | Reads PCR-positive and PCR-negative droplets with an optical detector |
| ddPCR Buffer Control for Probes | Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, USA | 1863052 | Blank control and to fill up the remaining wells of 8-well cassette |
| Software | |||
| QuantaSof Software | Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, USA | 1864011 | Program for droplet reading |
| Prism Windows 5 | GraphPad Software Inc., La Jolla, CA, USA | Program for statistical analysis |
Referenzen
- Schulte, C., Zeller, T. microRNA-based diagnostics and therapy in cardiovascular disease – summing up the facts. Cardiovascular Diagnosis and Therapy. 5, 17-36 (2015).
- Sun, T., et al. The role of microRNAs in myocardial infarction: from molecular mechanism to clinical application. International Journal of Molecular Sciences. 18, (2017).
- Dimmeler, S., Zeiher, A. M. Circulating microRNAs: novel biomarkers for cardiovascular diseases. European Heart Journal. 31, 2705-2707 (2010).
- Creemers, E. E., Tijsen, A. J., Pinto, Y. M. Circulating microRNAs: novel biomarkers and extracellular communicators in cardiovascular disease. Circulation Research. 110, 483-495 (2012).
- Oerlemans, M. I., et al. Early assessment of acute coronary syndromes in the emergency department: the potential diagnostic value of circulating microRNAs. EMBO Molecular Medicine. 4, 1176-1185 (2012).
- Olivieri, F., et al. Diagnostic potential of circulating miR-499-5p in elderly patients with acute non ST-elevation myocardial infarction. Internation Journal of Cardiology. 167, 531-536 (2013).
- Navickas, R., et al. Identifying circulating microRNAs as biomarkers of cardiovascular disease: a systematic review. Cardiovascular Research. 111, 322-337 (2016).
- Devaux, Y., et al. Diagnostic and prognostic value of circulating microRNAs in patients with acute chest pain. Journal of Internal Medicine. 277, 260-271 (2015).
- Schwarzenbach, H., da Silva, A. M., Calin, G., Pantel, K. Data normalization strategies for microRNA quantification. Clinical Chemistry. 61, 1333-1342 (2015).
- Hindson, B. J., et al. High-throughput droplet digital PCR system for absolute quantitation of DNA copy number. Analytical Chemistry. 83, 8604-8610 (2011).
- Hindson, C. M., et al. Absolute quantification by droplet digital PCR versus analog real-time PCR. Nature Methods. 10, 1003-1005 (2013).
- Robinson, S., et al. Droplet digital PCR as a novel detection method for quantifying microRNAs in acute myocardial infarction. Internation Journal of Cardiology. 257, 247-254 (2018).
- Mitchell, P. S., et al. Circulating microRNAs as stable blood-based markers for cancer detection. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. , 10513-10518 (2008).
- D’Alessandra, Y., et al. Circulating microRNAs are new and sensitive biomarkers of myocardial infarction. European Heart Journal. 31, 2765-2773 (2010).
- Forootan, A., et al. Methods to determine limit of detection and limit of quantification in quantitative real-time PCR (qPCR). Biomolecular Detection and Quantification. 12, 1-6 (2017).
- Dingle, T. C., Sedlak, R. H., Cook, L., Jerome, K. R. Tolerance of droplet-digital PCR vs real-time quantitative PCR to inhibitory substances. Clinical Chemistry. 59, 1670-1672 (2013).
- Taylor, S. C., Laperriere, G., Germain, H. Droplet digital PCR versus qPCR for gene expression analysis with low abundant targets: from variable nonsense to publication quality data. Scientific Reports. 7, 2409 (2017).
