급성 심근 경색 및 심혈 관 질환 MicroRNAs 순환 측정을 위한 디지털 PCR
Summary
순환 microRNAs는 심혈 관 질환 및 급성 심근 경색에 대 한 생체로 약속을 보여주었다. 이 연구에서 우리는 미르 추출, 반전 녹음 방송 및 심혈 관 질환 환자의 혈 청에서 miRNAs의 절대 정량화에 대 한 디지털 PCR 프로토콜을 설명합니다.
Abstract
순환 혈 청 microRNAs (miRNAs) 순환으로 심장 혈관 세포에서 출시 되는 심혈 관 질환 및 급성 심근 경색 (AMI), 대 한 생체로 약속을 보여왔다. 순환 miRNAs 매우 안정 하 고 측정할 수 있습니다. 특정 한 miRNAs의 양적 표현 병 리, 그리고 일부 miRNAs 쇼 높은 조직 및 질병 특이성에 연결할 수 있습니다. 심혈 관 질환에 대 한 새로운 바이오 마커를 찾는 의료 연구에 대 한 중요성 이다. 아주 최근에, 디지털 연쇄 반응 (dPCR) 발명 되었습니다. dPCR, 형광 가수분해 프로브와 함께 특정 직접 절대 정량화를 수 있습니다. dPCR 낮은 다양성, 높은 선형성 및 정량적 중 합 효소 연쇄 반응 (정량)에 비해 높은 감도 포함 하 여 우수한 기술적 특성을 전시 한다. 따라서, dPCR miRNAs, 특히 대형 멀티 센터 심장 혈관 임상에서 사용에 대 한 직접 측정 하는 더 정확 하 고 재현 가능한 방법 이다. 이 책에서 우리는 효과적으로 혈 청 샘플에 절대 복사 번호 평가 디지털 PCR을 수행 하는 방법을 설명 합니다.
Introduction
순환 miRNAs 질병, 심혈 관 질환1등의 숫자에 대 한 유망 표식으로 확인 되었습니다. miRNAs는 작은, 비 코딩 단일 가닥 RNA 분자 (약 22 뉴클레오티드 긴) 관련은 post-transcriptional 레 귤 레이 션 을 통해 메신저 RNA 번역 및 영향을 미치는 유전자 식2, 변경에 생리 적 및 병 적인 상태에 순환으로 해제 됩니다. 특정 miRNAs의 양적 표현, 병 리에 연결 될 수 있습니다 그리고 일부 miRNAs 보여 높은 조직과 질병 특이성1. 심혈 관 질환, miRNAs 되고있다 매력적인 후보자로 소설 생체 PCR 방법론3의 도움으로 측정할 수 있기 때문에 그들은 혈 청에 있는 현저 하 게 안정 하 고 쉽게 할 수 있다. 작은 연구에서 심근 경색에 대 한 생체로 miRNAs의 잠재적인 가치를 평가 하지만 큰 동료에서 유효성 검사2부족 이다. 예를 들어 미르-499 이다 높은 심근 근육 표현 발견 하 고 아미4,,56에 크게 증가를 보였다. 그것은 또한, 조절 프로그램 된 세포 죽음 (apoptosis)와 cardiomyocytes의 차별화 및 따라서 AMI7다음 몇 가지 메커니즘에 관련 된. 우월과 아미의 진단에 대 한 miRNAs의 증분 값을 보고 몇 가지 작은 연구를 제외 하 고 우월 또는 높은 감도 심장 troponins 평등 입증 되지 않은 아직 대규모 연구2,5 ,,68. 큰 동료에서 더 많은 예비 연구는, 따라서, miRNAs의 잠재적인 진단 가치를 평가할 필요 합니다. 또한, miRNA 정량화의 방법을 최적화 하 고9프로토콜 표준화를 사용 하 여 비교. 표준화 된 분석 실험 일관성 없는 결과 줄일 수 있습니다 하 고 일상적인 임상 응용 프로그램에 대 한 잠재적인 생체 되 miRNAs biomarkers 그들의 임상 적용 되도록 재현 방법으로 양이 정해질 필요가 도움이 될 수 있습니다.
최근, dPCR 끝점 분석으로 도입 되었습니다. 그것은 약 20000 개별 반응10샘플 파티션을. DPCR 시스템은 다음 수학 포아송 통계 분석 형광 신호 (긍정적이 고 부정적인 반응)의 표준 곡선10없이 절대 정량화를 사용를 사용 합니다. 때 dPCR를 결합 하 여 형광 가수분해 프로브, miRNAs의 매우 구체적인 직접 절대 정량화 가능한 이루어집니다. 디지털 연쇄 반응으로 나타났습니다 미르 수준 측정에 대 한 (를 포함 하 여 감소 변화, 증가 일상적인 재현성, 선형성의 고차 및 높은 감도) 우량한 기술적인 질을 전시 하는 순환 양적 실시간 PCR10,11에 비해. 이러한 우수한 기술적 특성 생체로 순환 miRNAs를 사용 하 여 현재 한계를 완화 하는 데 도움이 될 수 있습니다. 및 biomarkers 대형 멀티 센터 심장 혈관 임상에서과에서 진단 방법으로 miRNAs의 설립으로 이어질 수 있습니다. 일반. 이전 연구에서 우리는 최근 miRNAs는 AMI 환자의 순환의 절대 정량화에 대 한 dPCR를 적용 하 고 정량12miRNAs의 정량화에 비해 우수한 진단 가능성을 입증 할 수 있었다.
이 출판물에는 dPCR를 사용 하 여 직접 심장 혈관 miRNAs 순환 측정에 대 한 정확 하 고 재현 방법 설명 하겠습니다. 혈 청, 디지털 PCR를 사용 하 여 미르 수준 절대 정량화 대형 멀티 센터 심장 혈관 임상 시험에 사용에 대 한 잠재적인 보여줍니다. 이 책에서 우리가 자세히 설명 효과적으로 디지털 PCR을 수행 하는 방법 및 혈 청에 절대 미르 복사본 수를 검출 하는 방법.
Protocol
Representative Results
Discussion
디지털 PCR PCR는 샘플 내에서 핵 산의 직접 절대 정량화를 허용 하는 상대적으로 새로운 끝점 방법입니다. 메서드를 사용 하면 감소 변화, 증가 일상적인 재현성 및 우수한 감도11,12를 포함 하 여 특정 장점을 있습니다. 또한, 분할 샘플의 약 20000 단일 반응 및 끝점 분석으로, 때문에 dPCR는에 더 강력한 PCR 양적 RT-PCR16에 비해 간섭 물질. DP…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
저자 아무 승인 있다.
Materials
| RNA-Extraction | |||
| miRNeasy Serum/Plasma Kit (50) | Qiagen-Sample & Assay Technologies, Hilden, Deutschland | 217184 | Kit for microRNA extraction. Kit contains commercial buffer RWT (called number one in the manuscript) and RPE (called number two in manuscript). |
| miRNeasy Serum/Plasma Spike-in-Control; Syn-cel-miR-39 miRNA; 10pmol | Qiagen-Sample & Assay Technologies, Hilden, Deutschland | 219610 | Spike-in for normalisation , Sequence: 5'-UCACCGGGUGUAAAUCAGCUUG-3' |
| Reverse Transcription | |||
| TaqMan MicroRNA Reverse Transcription Kit (1000 Reactions) | Applied Biosystems, Inc., Foster City, CA, USA | 4366597 | Kit for microRNA reverse transcription |
| TaqMan MicroRNA Assays M | Applied Biosystems, Inc., Foster City, CA, USA | 4440887 | Assays used in reverse transcription |
| hsa-miR-499 (750 RT/750 PCR rxns) | Applied Biosystems, Inc., Foster City, CA, USA | 4440887 | Assay Number 001352 |
| cel-miR-39 (750 RT/750 PCR rxns) | Applied Biosystems, Inc., Foster City, CA, USA | 4440887 | Assay Number 000200 |
| PCR Plate, 96-well, segmented, semi-skirted | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA | AB0900 | 96 well plate for reverse transcription |
| Microseal ‘B’ seal Seals | Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, USA | MSB1001 | Foil to ensure proper storage |
| C1000 Touch Thermal Cycler | Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, USA | 1851196 | Cycler used for reverse transcription |
| Droplet Digital PCR | |||
| 100 nmole RNA oligo hsa-miR-499-5p | Integrated DNA Technologies | Custom | Sequence: 5'-phos-UUAAGACUUGCAGUGAUGUUU-3' |
| ddPCR Supermix for Probes (No dUTP) | Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, USA | 1863024 | Supermix used in droplet generation |
| TaqMan MicroRNA Assays | Applied Biosystems, Inc., Foster City, CA, USA | 4440887 | Assays used in digital PCR (fluorescent hydrolysis probe) |
| hsa-miR-499 (750 RT/750 PCR rxns) | Applied Biosystems, Inc., Foster City, CA, USA | 4440887 | Assay Number 001352, commercial primers |
| cel-miR-39 (750 RT/750 PCR rxns) | Applied Biosystems, Inc., Foster City, CA, USA | 4440887 | Assay Number 000200, commercial primers |
| DG8 Cartridges and Gaskets | Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, USA | 1864007 | Cartridge takes up to 8 samples for droplet generation |
| DG8 Cartridge Holder | Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, USA | 1863051 | Holds cartridges in droplet generation |
| Droplet Generation Oil for Probes | Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, USA | 1863005 | Oil used in droplet generation |
| ddPCR 96-Well Plates | Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, USA | 12001925 | 96 well plate for ddPCR |
| PCR Plate Heat Seal, foil, pierceable | Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, USA | 1814040 | Pierceable foil, compatible with droplet reader |
| ddPCR Droplet Reader Oil | Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, USA | 1863004 | Oil used in droplet reading |
| QX100 or QX200 Droplet Generator | Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, USA | 1863002 | Droplet Generator, generates the droplets from sample/oil emulsion |
| PX1 PCR Plate Sealer | Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, USA | 1814000 | Seals the plate before PCR |
| C1000 Touch Thermal Cycler | Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, USA | 1851196 | Cycler used for ddPCR |
| QX100 or QX200 Droplet Reader | Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, USA | 1863003 | Reads PCR-positive and PCR-negative droplets with an optical detector |
| ddPCR Buffer Control for Probes | Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, USA | 1863052 | Blank control and to fill up the remaining wells of 8-well cassette |
| Software | |||
| QuantaSof Software | Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, USA | 1864011 | Program for droplet reading |
| Prism Windows 5 | GraphPad Software Inc., La Jolla, CA, USA | Program for statistical analysis |
Referenzen
- Schulte, C., Zeller, T. microRNA-based diagnostics and therapy in cardiovascular disease – summing up the facts. Cardiovascular Diagnosis and Therapy. 5, 17-36 (2015).
- Sun, T., et al. The role of microRNAs in myocardial infarction: from molecular mechanism to clinical application. International Journal of Molecular Sciences. 18, (2017).
- Dimmeler, S., Zeiher, A. M. Circulating microRNAs: novel biomarkers for cardiovascular diseases. European Heart Journal. 31, 2705-2707 (2010).
- Creemers, E. E., Tijsen, A. J., Pinto, Y. M. Circulating microRNAs: novel biomarkers and extracellular communicators in cardiovascular disease. Circulation Research. 110, 483-495 (2012).
- Oerlemans, M. I., et al. Early assessment of acute coronary syndromes in the emergency department: the potential diagnostic value of circulating microRNAs. EMBO Molecular Medicine. 4, 1176-1185 (2012).
- Olivieri, F., et al. Diagnostic potential of circulating miR-499-5p in elderly patients with acute non ST-elevation myocardial infarction. Internation Journal of Cardiology. 167, 531-536 (2013).
- Navickas, R., et al. Identifying circulating microRNAs as biomarkers of cardiovascular disease: a systematic review. Cardiovascular Research. 111, 322-337 (2016).
- Devaux, Y., et al. Diagnostic and prognostic value of circulating microRNAs in patients with acute chest pain. Journal of Internal Medicine. 277, 260-271 (2015).
- Schwarzenbach, H., da Silva, A. M., Calin, G., Pantel, K. Data normalization strategies for microRNA quantification. Clinical Chemistry. 61, 1333-1342 (2015).
- Hindson, B. J., et al. High-throughput droplet digital PCR system for absolute quantitation of DNA copy number. Analytical Chemistry. 83, 8604-8610 (2011).
- Hindson, C. M., et al. Absolute quantification by droplet digital PCR versus analog real-time PCR. Nature Methods. 10, 1003-1005 (2013).
- Robinson, S., et al. Droplet digital PCR as a novel detection method for quantifying microRNAs in acute myocardial infarction. Internation Journal of Cardiology. 257, 247-254 (2018).
- Mitchell, P. S., et al. Circulating microRNAs as stable blood-based markers for cancer detection. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. , 10513-10518 (2008).
- D’Alessandra, Y., et al. Circulating microRNAs are new and sensitive biomarkers of myocardial infarction. European Heart Journal. 31, 2765-2773 (2010).
- Forootan, A., et al. Methods to determine limit of detection and limit of quantification in quantitative real-time PCR (qPCR). Biomolecular Detection and Quantification. 12, 1-6 (2017).
- Dingle, T. C., Sedlak, R. H., Cook, L., Jerome, K. R. Tolerance of droplet-digital PCR vs real-time quantitative PCR to inhibitory substances. Clinical Chemistry. 59, 1670-1672 (2013).
- Taylor, S. C., Laperriere, G., Germain, H. Droplet digital PCR versus qPCR for gene expression analysis with low abundant targets: from variable nonsense to publication quality data. Scientific Reports. 7, 2409 (2017).
