الإنزيم إيمونوبريسيبيتيشن الكروماتين لتحديد الجينات المستهدفة NFAT2 الرواية في سرطان الدم الليمفاوي المزمن
Summary
سرطان الدم الليمفاوي المزمن (CLL) هو سرطان الدم الأكثر شيوعاً في العالم الغربي. هي عوامل النسخ نفات المنظمين هامة للتنمية والتنشيط في العديد من أنواع الخلايا. نقدم هنا، بروتوكول لاستخدام لونين إيمونوبريسيبيتيشن (رقاقة) في الخلايا البشرية CLL لتحديد الجينات المستهدفة رواية من NFAT2.
Abstract
سرطان الدم الليمفاوي المزمن (CLL) تتسم بالتوسع في استنساخ الخبيثة بالخليه، ويمثل سرطان الدم الأكثر شيوعاً في البلدان الغربية. وتظهر غالبية المرضى CLL مساراً كسول للمرض وكذلك النمط الظاهري أنيرجيك على خلايا سرطان الدم، مشيراً إلى مستقبلات خلية بلا تستجيب للمؤثر الخارجي. وقد أظهرنا مؤخرا أن عامل النسخ NFAT2 منظم حاسمة من استعطال في CLL. تحديا كبيرا في تحليل دور عامل النسخ في أمراض مختلفة هي تحديد الجينات المستهدفة المحددة لها. وهذا له أهمية كبيرة لتوضيح آليات pathogenetic والتدخلات العلاجية المحتملة. إيمونوبريسيبيتيشن الكروماتين (شريحة) هو أسلوب كلاسيكي لإظهار تفاعلات البروتين-الحمض النووي ويمكن، لذلك، تحديد الجينات هدفا مباشرا لعوامل النسخ في خلايا الثدييات. هنا، استخدمت شريحة لتحديد لك كجينات مستهدفة مباشرة من NFAT2 في الخلايا CLL البشرية. الحمض النووي والبروتينات المرتبطة كروسلينكيد استخدام فورمالدهايد والمنفصمة فيما بعد من سونيكيشن إلى شظايا من الحمض النووي من حوالي 200-500 قاعدة أزواج (bp). Cross-linked شظايا من الحمض النووي المرتبطة NFAT2، ثم بشكل انتقائي إيمونوبريسيبيتاتيد من الحطام الخلية باستخدام جسم مضاد αNFAT2. بعد تنقية، يتم الكشف عن شظايا من الحمض النووي المرتبطة بها عن طريق PCR الكمي في الوقت الحقيقي (قرة-PCR). تسلسل الحمض النووي بتخصيب واضحا تمثل مناطق الجينوم التي تستهدفها NFAT2 في فيفو. القص المناسب للحمض النووي، واختيار جسم المطلوبة أهمية حاسمة لنجاح تطبيق هذا الأسلوب. هذا البروتوكول مثالي لمظاهرة التفاعلات المباشرة من NFAT2 مع الجينات المستهدفة. قصره الرئيسي هو صعوبة توظيف الرقائق في فحوصات واسعة النطاق تحليل الجينات المستهدفة لعدة عوامل النسخ في الكائنات الحية سليمة.
Introduction
سرطان الدم الليمفاوي المزمن (CLL) يمثل سرطان الدم الأكثر شيوعاً في البالغين في البلدان الغربية، نستعرض تراكم متميزة CD19 و CD23 CD5 معربا عن ب نضجاً الخلايا1. معظم المرضى يحمل بالطبع مرض كسول، الذي ليس بالضرورة معاملة محددة لسنوات عديدة. وفي المقابل، تظهر بعض المرضى التقدم السريع التي تتطلب التدخلات العلاجية الفورية مع العلاج الكيميائي المناعي أو غيرها العلاجات المستهدفة2،3. العامل النووي لتنشيط خلايا تي (نفات) عائلة من عوامل النسخ التحكم المختلفة الإنمائية وعمليات التنشيط في الخلية العديد أنواع4،،من56. مؤخرا أثبتنا overexpression وتفعيل NFAT2 في خلايا CLL الدستورية من المرضى الذين يعانون من المرض كسول7. هنا، وهو ينظم إقامة دولة لا تستجيب لتحفيز مستقبلات الخلية بتسمي استعطال7. لإثبات أن NFAT2 بربط البروتين الخاصة بالخلايا اللمفاوية تيروزين كيناز (لك) المروج وينظم لك التعبير في CLL الخلايا البشرية، الإنزيم إيمونوبريسيبيتيشن الكروماتين محددة (شريحة) والعاملين.
رقاقة واحد من عدة تقنيات للتحقيق في دور عوامل النسخ في التعبير الجيني8. أحكام مدبرة التعبير الجيني بطريقة معقدة جداً من المنظمين عدة مع عوامل النسخ أخذ جزءا لا يمكن الاستغناء عنه في هذه العملية9،10،،من1112. وتم تحديد عوامل النسخ تنظيم التعبير الجيني في إطار المكانية والزمانية في عديدة الأنواع (مثل التنمية والتمايز)13،،من1415، 17،،من 1618. الأخطاء في آليات التحكم المعقدة التي تنطوي على عوامل النسخ يمكن أن يؤدي إلى مجموعة متنوعة من العمليات باثولوجي بما في ذلك السرطان19،20. ومن ثم، تحديد عوامل النسخ وأهدافها الخاصة بكل منها قد توفر السبل العلاجية رواية21،22. تتوفر طرق عدة للتحقيق في هذا المجال مثيرة للاهتمام مثل رقاقة والتنقل الغرواني الكهربي التحول المقايسة (أمسا) ومختلف فحوصات الحمض النووي المنسدلة وفحوصات مراسل8،،من1112، 23 , 24.
لإثبات أن عامل نسخ يتفاعل مع مناطق محددة من الجينوم هو المجراة، رقاقة أسلوب مثالي25. لهذا الغرض، تصميمهما الحمض النووي والبروتينات المرتبطة بها في الخلايا الحية هي استخدام الإشعاعات فوق البنفسجية أو فورمالدهايد (رقاقة cross-linked، شكيب). تم حذف هذه الخطوة للحصول على أفضل الحمض النووي والبروتين الانتعاش في رقاقة (نكيب) أصلي ما يسمى26. هي المنفصمة مجمعات البروتين الحمض النووي في وقت لاحق من سونيكيشن إلى شظايا من حوالي 200-500 زوج قاعدي (bp) وإيمونوبريسيبيتاتيد من بين الأنقاض الخلية استخدام جسم معين ضد عامل النسخ للفائدة. أجزاء الحمض النووي المرتبطة بها ثم تنقيته وتتميز ببكر والاستنساخ الجزيئي وتسلسلها. استخدام تقنيات بديلة [ميكروارس] (رقاقة على رقاقة) أو تسلسل الجيل القادم (الرقائق-Seq) لتحليل إيمونوبريسيبيتاتيد الحمض النووي.
رقاقة قدم لأول مرة قبل جيلمور و Lis عام 1984 عندما كانت تستخدم الأشعة فوق البنفسجية ضوء تساهمي قياس الحمض النووي والالتزام البروتينات في المعيشة البكتيريا27. تحلل الخلايا وإيمونوبريسيبيتيشن من البكتيريا الحمض النووي الريبي بوليميراز، استخدمت تحقيقات محددة من الجينات المعروفة لخريطة توزيع في فيفو وكثافة من الحمض النووي الريبي بوليميراز. بعد ذلك استخدمت الأسلوب المحققون نفس لتحليل توزيع التوكسينات رنا بوليميراز الثاني على جينات بروتين الصدمة الحرارة في المورفولوجية28. وقد صقل المقايسة شكيب فارشافسكي وزملاء العمل الذين أول من استخدم فورمالدهايد العابرة للربط إلى دراسة رابطة هيستون H4 مع الحرارة صدمة البروتين الجينات29،30. النهج نكيب، الذي يحمل في الاستفادة من انتعاش الحمض النووي والبروتين أفضل نتيجة سليمة وبطبيعة الحال [ابيتوبس]، وذلك، أولاً وصف أكبر جسم خصوصية، حبيس والزملاء في عام 198831.
ميزة رقاقة بالمقارنة مع التقنيات الأخرى لتحليل التفاعلات البروتين الحمض النووي هو في الواقع، أن التفاعل الفعلي لعامل النسخ يمكن التحقيق في فيفو وعدم إجراء تحقيقات أو ظروف صناعية تم إنشاؤها بواسطة المخازن المؤقتة أو المواد الهلامية ويعمل11،،من812. عن طريق الجمع بين شرائح مع تسلسل الجيل القادم، يمكن تحديد أهداف متعددة في وقت واحد.
القيود الرئيسية لهذا الأسلوب يتم تطبيقه محدودا لفحوصات على نطاق واسع في الكائنات الحية سليمة25. كما يمكن تحليل أنماط التعبير الجيني التفاضلي الصعبة باستخدام تقنيات الرقائق إذا كان يعبر عن البروتينات منها فقط عند مستويات منخفضة أو خلال الإطارات الزمنية الضيقة. عامل يحتمل أن تحد آخر هو توافر جسم مناسبة ملائمة لرقاقة11.
البروتوكول رقاقة المعروضة هنا يمكن أن تستخدمها لتحديد الجينات المستهدفة عامل النسخ في فيفو الكمي PCR الوقت الحقيقي (قرة-PCR). على وجه التحديد، كان الهدف لتحديد الجينات المستهدفة رواية من NFAT2 في CLL. رقاقة اختير بسبب قدرتها على إظهار ربط NFAT2 إلى مناطق المروج الجينات المستهدفة المختلفة تحت الظروف الطبيعية في خلايا المريض CLL الإنسان مباشرة.
Protocol
Representative Results
Discussion
الخطوات الحاسمة القيام مقايسة رقاقة ناجحة هي اختيار جسم المناسبة والاستفادة المثلى من الكروماتين القص عملية25. اختيار جسم αNFAT2 ثبت أن يشكل تحديا كبيرا أثناء وضع هذا البروتوكول. بينما توجد العديد من الأجسام المضادة αNFAT2 المتاحة تجارياً وغالبية هذه يعمل بشكل جيد النشاف الغربية …
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
هذا العمل كان يدعمها DFG منح مو 3340/1-1 وكريبشيلفي الألمانية منح 111134 (سواء منحت إلى M.R.M.). ونحن نشكر ملنك الكه للمساعدة التقنية الممتازة).
Materials
| 1 X PBS | Sigma Aldrich | D8537 | |
| 1.5 mL tube shaker Themomixer comfort | Eppendorf | 5355 000.011 | Can be substituted with similar instruments |
| 10X Bolt Sample Reducing Agent | Thermo Scientific | B0009 | |
| 20X Bolt MES SDS Running Buffer | Thermo Scientific | B0002 | |
| 37 % Formaldehyde p.a., ACS | Roth | 4979.1 | |
| 4X Bolt LDS Sample Buffer | Thermo Scientific | B0007 | |
| Anti-NFAT2 antibody | Alexis | 1008505 | Clone 7A6 |
| Anti-NFAT2 antibody | Cell Signaling | 8032S | Clone D15F1 |
| Anti-NFAT2 antibody ChIP Grade | Abcam | ab2796 | Clone 7A6 |
| big Centrifuge | Eppendorf | 5804R | Can be substituted with similar instruments |
| CD19-FITC mouse Anti-human | BD Biosciences | 555412 | Clone HIB19 |
| CD5-PE mouse Anti-human CD5 | BD Biosciences | 555353 | Clone UCHT2 |
| Density gradient medium Biocoll (Density 1,077 g/ml) | Merck | L 6115 | |
| DNA LoBind Tube 1.5 mL | eppendorf | 22431021 | |
| FBS superior | Merck | S0615 | |
| Flow Cytometer | BD Biosciences | FACSCalibur | Can be substituted with similar instruments |
| Halt Protease and Phosphatase Inhibitor Cocktail (100X) | Thermo Scientific | 78440 | |
| iBlot 2 Gel Transfer Device | Thermo Scientific | IB21001 | |
| iBlot 2 Transfer Stacks, nitrocellulose, regular size | Thermo Scientific | IB23001 | |
| iDeal ChIp-seq kit for Histones | Diagenode | C01010059 | |
| Ionomycin calcium salt | Sigma Aldrich | I3909 | |
| IRDye 680LT Donkey anti-Rabbit IgG (H + L), 0.5 mg | LI-COR Biosciences | 926-68023 | |
| IRDye 800CW Goat anti-Mouse IgG (H + L), 0.1 mg | LI-COR Biosciences | 925-32210 | |
| LI-COR Odyssey Infrared Imaging System | LI-COR Biosciences | B446 | |
| LightCycler 480 Multiwell Plate 96, white | Roche | 4729692001 | Can be substituted with other plates in different real-time PCR instruments |
| Lysing Solution OptiLyse B | Beckman Coulter | IM1400 | |
| M220 AFA-grade water | Covaris | 520101 | |
| M220 Focused-ultrasonicator | Covaris | 500295 | |
| Magnetic rack, DynaMag-15 Magnet | Thermo Scientific | 12301D | Can be substituted with similar instruments |
| MEM Non-Essential Amino Acids Solution 100X | Thermo Scientific | 11140050 | |
| Microscope Axiovert 25 | Zeiss | 451200 | Can be substituted with similar instruments |
| microTUBE AFA Fiber Pre-Slit Snap-Cap 6x16mm | Covaris | 520045 | |
| Neubauer improved counting chamber | Karl Hecht GmbH & Co KG | 40442012 | Can be substituted with similar instruments |
| NH4 Heparin Monovette | Sarstedt | 02.1064 | |
| Nuclease-free water | Promega | P1193 | |
| NuPAGE 4-12% Bis-Tris Protein Gels, 1.0 mm, 15-well | Thermo Scientific | NP0323BOX | |
| Odyssey® Blocking Buffer (TBS) 500 mL | LI-COR Biosciences | 927-50000 | |
| Penicillin/Streptomycin 100X | Merck | A2213 | |
| PerfeCTa SYBR Green FastMix | Quanta Bio | 95072-012 | |
| PMA | Sigma Aldrich | P1585 | |
| Primer CD40L promotor region forward | Sigma Aldrich | 5’-ACTCGGTGTTAGCCAGG-3’ | |
| Primer CD40L promotor region reverse | Sigma Aldrich | 5’-GGGCTCTTGGGTGCTATTGT -3’ | |
| Primer IL-2 promotor region forward | Sigma Aldrich | 5’-TCCAAAGAGTCATCAGAAGAG-3’ | |
| Primer IL-2 promotor region reverse | Sigma Aldrich | 5’-GGCAGGAGTTGAGGTTACTGT-3’ | |
| Primer LCK promotor region forward | Sigma Aldrich | 5’-CAGGCAAAACAGGCACACAT-3’ | |
| Primer LCK promotor region reverse | Sigma Aldrich | 5’-CCTCCAGTGACTCTGTTGGC-3’ | |
| Rabbit mAb IgG XP Isotype Control | Cell Signaling | # 3900S | Clone DA1E |
| Real-time PCR instrument | Roche | LightCycler 480 | Can be substituted with similar instruments |
| Roller mixers | Phoenix Instrument | RS-TR 5 | |
| RPMI 1640 Medium, GlutaMAX Supplement | Thermo Scientific | 61870010 | |
| Safety-Multifly-needle 21G | Sarstedt | 851638235 | |
| SeeBlue Plus2 Pre-stained Protein Standard | Thermo Scientific | LC5925 | |
| Shaker Duomax 1030 | Heidolph Instruments | 543-32205-00 | Can be substituted with similar instruments |
| small Centrifuge | Thermo Scientific | Heraeus Fresco 17 | Can be substituted with similar instruments |
| Sodium Pyruvate | Thermo Scientific | 11360070 | |
| ß-Mercaptoethanol | Thermo Scientific | 21985023 | |
| Tris Buffered Saline (TBS-10X) | Cell Signaling | #12498 | |
| Trypan Blue solution | Sigma Aldrich | 93595-50ML |
Referenzen
- Byrd, J. C., Jones, J. J., Woyach, J. A., Johnson, A. J., Flynn, J. M. Entering the Era of Targeted Therapy for Chronic Lymphocytic Leukemia: Impact on the Practicing Clinician. Journal of Clinical Oncology. 32 (27), 3039-3047 (2014).
- Woyach, J. A. Survival of the weak (signalers): anergy in CLL. Blood. 121 (19), 3781-3783 (2013).
- Hallek, M., et al. Guidelines for diagnosis, indications for treatment, response assessment and supportive management of chronic lymphocytic. Blood. , (2018).
- Hogan, P. G., Chen, L., Nardone, J., Rao, A. Transcriptional regulation by calcium, calcineurin, and NFAT. Genes and Development. 17 (18), 2205-2232 (2003).
- Macian, F. NFAT proteins: key regulators of T-cell development and function. Nature Reviews Immunology. 5 (6), 472-484 (2005).
- Muller, M. R., Rao, A. NFAT, immunity and cancer: a transcription factor comes of age. Nature Reviews Immunology. 10 (9), 645-656 (2010).
- Marklin, M., et al. NFAT2 is a critical regulator of the anergic phenotype in chronic lymphocytic leukaemia. Nature Communications. 8 (1), 755 (2017).
- Geertz, M., Maerkl, S. J. Experimental strategies for studying transcription factor-DNA binding specificities. Briefings in Functional Genomics. 9 (5-6), 362-373 (2010).
- Slattery, M., et al. Absence of a simple code: how transcription factors read the genome. Trends in Biochemical Sciences. 39 (9), 381-399 (2014).
- Cumbo, F., Vergni, D., Santoni, D. Investigating transcription factor synergism in humans. DNA Research. , (2017).
- Gade, P., Kalvakolanu, D. V. Chromatin Immunoprecipitation Assay as a Tool for Analyzing Transcription Factor Activity. Methods in molecular biology. 809, 85-104 (2012).
- Mundade, R., Ozer, H. G., Wei, H., Prabhu, L., Lu, T. Role of ChIP-seq in the discovery of transcription factor binding sites, differential gene regulation mechanism, epigenetic marks and beyond. Cell Cycle. 13 (18), 2847-2852 (2014).
- Flores, E., Picossi, S., Valladares, A., Herrero, A. Transcriptional regulation of development in heterocyst-forming cyanobacteria. Biochimica et Biophysica Acta. , (2018).
- Callens, C., Tucker, M. R., Zhang, D., Wilson, Z. A. Dissecting the role of MADS-box genes in monocot floral development and diversity. Journal of Experimental Botany. 69 (10), 2435-2459 (2018).
- Shen, Q., Toulabi, L. B., Shi, H., Nicklow, E. E., Liu, J. The forkhead transcription factor UNC-130/FOXD integrates both BMP and Notch signaling to regulate dorsoventral patterning of the C. elegans postembryonic mesoderm. Entwicklungsbiologie. 433 (1), 75-83 (2018).
- Tang, X., Zhao, Y., Buchon, N., Engstrom, Y. The POU/Oct Transcription Factor Nubbin Controls the Balance of Intestinal Stem Cell Maintenance and Differentiation by Isoform-Specific Regulation. Stem Cell Reports. , (2018).
- Bertacchi, M., Parisot, J., Studer, M. The pleiotropic transcriptional regulator coup-tfi plays multiple roles in neural development and disease. Brain Research. , (2018).
- Aronson, B. E., Stapleton, K. A., Krasinski, S. D. Role of GATA factors in development, differentiation, and homeostasis of the small intestinal epithelium. American Journal of Physiology: Gastrointestinal and Liver Physiology. 306 (6), G474-G490 (2014).
- Fernandez, L. P., Lopez-Marquez, A., Santisteban, P. Thyroid transcription factors in development, differentiation and disease. Nature Reviews: Endocrinology. 11 (1), 29-42 (2015).
- Jiang, S., et al. Novel role of Forkhead box O 4 transcription factor in cancer: bringing out the good or the bad. Seminars in Cancer Biology. , (2018).
- Daniel, P. M., et al. PI3K Activation in Neural Stem Cells Drives Tumorigenesis which can be Ameliorated by Targeting the cAMP Response Element Binding (CREB) Protein. Neuro-Oncology. , (2018).
- Chen, W. T., Chen, Y. K., Lin, S. S., Hsu, F. T. Hyperforin Suppresses Tumor Growth and NF-kappaB-mediated Anti-apoptotic and Invasive Potential of Non-small Cell Lung Cancer. Anticancer Research. 38 (4), 2161-2167 (2018).
- Ausubel, F. M. . Current protocols in molecular biology. , (1994).
- Garner, M. M., Revzin, A. A gel electrophoresis method for quantifying the binding of proteins to specific DNA regions: application to components of the Escherichia coli lactose operon regulatory system. Nucleic Acids Research. 9 (13), 3047-3060 (1981).
- Fujita, T., Fujii, H. Biochemical Analysis of Genome Functions Using Locus-Specific Chromatin Immunoprecipitation Technologies. Gene Regulation and Systems Biology. 10 (Suppl 1), 1-9 (2016).
- O’Neill, L. P., Turner, B. M. Immunoprecipitation of native chromatin: NChIP. Methods. 31 (1), 76-82 (2003).
- Gilmour, D. S., Lis, J. T. Detecting protein-DNA interactions in vivo: distribution of RNA polymerase on specific bacterial genes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 81 (14), 4275-4279 (1984).
- Gilmour, D. S., Lis, J. T. In vivo interactions of RNA polymerase II with genes of Drosophila melanogaster. Molecular and Cellular Biology. 5 (8), 2009-2018 (1985).
- Solomon, M. J., Larsen, P. L., Varshavsky, A. Mapping protein-DNA interactions in vivo with formaldehyde: evidence that histone H4 is retained on a highly transcribed gene. Cell. 53 (6), 937-947 (1988).
- Varshavsky, A. Discovery of cellular regulation by protein degradation. Journal of Biological Chemistry. 283 (50), 34469-34489 (2008).
- Hebbes, T. R., Thorne, A. W., Crane-Robinson, C. A direct link between core histone acetylation and transcriptionally active chromatin. EMBO Journal. 7 (5), 1395-1402 (1988).
- Decker, E. L., Skerka, C., Zipfel, P. F. The early growth response protein (EGR-1) regulates interleukin-2 transcription by synergistic interaction with the nuclear factor of activated T cells. Journal of Biological Chemistry. 273 (41), 26923-26930 (1998).
- Grammer, A. C., et al. The CD40 ligand expressed by human B cells costimulates B cell responses. Journal of Immunology. 154 (10), 4996-5010 (1995).
- Pham, L. V., Tamayo, A. T., Yoshimura, L. C., Lin-Lee, Y. C., Ford, R. J. Constitutive NF-kappaB and NFAT activation in aggressive B-cell lymphomas synergistically activates the CD154 gene and maintains lymphoma cell survival. Blood. 106 (12), 3940-3947 (2005).
- Zhou, Z. H., et al. The acid-sensing ion channel, ASIC2, promotes invasion and metastasis of colorectal cancer under acidosis by activating the calcineurin/NFAT1 axis. Journal of Experimental and Clinical Cancer Research. 36 (1), 130 (2017).
- Estrada-Aviles, R., Rodriguez, G., Zarain-Herzberg, A. The cardiac calsequestrin gene transcription is modulated at the promoter by NFAT and MEF-2 transcription factors. PloS One. 12 (9), e0184724 (2017).
- Kadziolka, B., Lesniak, W., Filipek, A. Regulation of CacyBP/SIP expression by NFAT1 transcription factor. Immunobiology. 222 (8-9), 872-877 (2017).
- Lieb, J. D., Liu, X., Botstein, D., Brown, P. O. Promoter-specific binding of Rap1 revealed by genome-wide maps of protein-DNA association. Nature Genetics. 28 (4), 327-334 (2001).
- Ren, B., et al. Genome-wide location and function of DNA binding proteins. Science. 290 (5500), 2306-2309 (2000).
- Iyer, V. R., et al. Genomic binding sites of the yeast cell-cycle transcription factors SBF and MBF. Nature. 409 (6819), 533-538 (2001).
- Johnson, D. S., Mortazavi, A., Myers, R. M., Wold, B. Genome-wide mapping of in vivo protein-DNA interactions. Science. 316 (5830), 1497-1502 (2007).
- Robertson, G., et al. Genome-wide profiles of STAT1 DNA association using chromatin immunoprecipitation and massively parallel sequencing. Nature Methods. 4 (8), 651-657 (2007).
- Schmid, C. D., Bucher, P. ChIP-Seq data reveal nucleosome architecture of human promoters. Cell. 131 (5), 831-832 (2007).
