כרומטין Immunoprecipitation Assay לזיהוי NFAT2 הרומן גנים היעד בלוקמיה לימפוציטית כרונית
Summary
לוקמיה לימפוציטית כרונית (CLL) הוא הלוקמיה הנפוץ ביותר בעולם המערבי. גורמי שעתוק NFAT הן הרגולטורים חשוב של פיתוח והפעלה סוגי תאים רבים. כאן, אנו מציגים את פרוטוקול לשימוש של כרומטין immunoprecipitation (ChIP) בתאי CLL אדם לזיהוי גנים היעד הרומן של NFAT2.
Abstract
לוקמיה לימפוציטית כרונית (CLL) מאופיין על-ידי ההרחבה של תא B ממאיר שיבוטים ומייצג הלוקמיה הנפוץ במדינות המערב. רוב החולים CLL הצג מסלול indolent של המחלה, כמו גם של פנוטיפ anergic של תאים לוקמיה שלהם, בהתייחסו קולטן תא B להגיב גירויים חיצוניים. אנחנו לאחרונה הראו כי הגורם שעתוק NFAT2 מווסת מכריע של anergy ב- CLL. האתגר העיקרי בניתוח של התפקיד של פקטור שעתוק במחלות שונות הוא הזיהוי של הגנים שלו ביעד מסוים. זה משמעות רבה עבור הבהרה של מנגנונים pathogenetic והתערבויות טיפוליות אפשריות. כרומטין immunoprecipitation (ChIP) היא טכניקה קלאסית להפגין אינטראקציות חלבון-DNA ו, לכן, ניתן להשתמש לזיהוי גנים היעד הישיר של גורמי שעתוק בתאי יונקים. כאן, שבב שימש כדי לזהות LCK גן היעד הישיר של NFAT2 בתאי CLL אדם. ה-DNA, חלבונים הקשורים תפור באמצעות פורמלין, לאחר מכן לכסנתם על ידי sonication לחלקים הדנ א של 200-500 בסיסי זוגות (bp). שברי DNA צולבים המשויך NFAT2 נארזים בצורה סלקטיבית immunoprecipitated של שאריות תאים באמצעות נוגדן αNFAT2. לאחר טיהור, שברי DNA המשויך מזוהים באמצעות PCR כמותי בזמן אמת (לרביעיית-PCR). רצפי DNA עם העשרה ניכר מייצגים אזורים בגנום אשר מיועדים על-ידי NFAT2 ויוו. ההטיה המתאימה של ה-DNA, הבחירה של הנוגדן נדרש מכריעים במיוחד עבור היישום המוצלח של שיטה זו. פרוטוקול זה הינו אידיאלי עבור ההדגמה של אינטראקציות ישיר של NFAT2 עם גנים היעד. הגבלה העיקרי שלה הוא הקושי להעסיק. את השבב של מבחני בקנה מידה גדול לנתח את הגנים היעד של מספר גורמי שעתוק אורגניזמים שלמים.
Introduction
לוקמיה לימפוציטית כרונית (CLL) מייצג הלוקמיה הנפוץ ביותר אצל מבוגרים במדינות המערב, מפגין ברורים הצטברות CD19 CD23, CD5 לבטא בוגרת B תאים1. רוב המטופלים התערוכה קורס מחלת indolent, אשר לא מחייבים טיפול מיוחד במשך שנים רבות. לעומת זאת, חלק מהחולים מראים התקדמות מהירה המחייבים התערבויות טיפוליות מיידית עם החיסון-כימותרפיה או טיפולים ממוקדים אחרים,2,3. גרעיני גורם של תאי T מופעל (NFAT) היא משפחה של גורמי שעתוק השליטה התפתחותיים שונים ותהליכים הפעלה5,4,סוגי תאים רבים6. אנחנו לאחרונה הפגינו ביטוי והפעלה החוקתי של NFAT2 בתאי CLL מחולים עם מחלת indolent7. . כאן, זה מסדיר מצב לא להגיב כדי גירוי קולטן תא B נקרא anergy7. כדי להדגים NFAT2 נקשר חלבון ספציפי לימפוציט טירוזין קינאז (מזל) האמרגן ומסדיר LCK ביטוי בתאי CLL אדם, וזמינותו immunoprecipitation כרומטין ספציפי (ChIP) פיתח, המועסקים.
השבב הוא אחד מספר טכניקות כדי לחקור את התפקיד של גורמי שעתוק גנים ביטוי8. ביטוי גנים הוא הדוק בניצוחו בצורה מאוד מורכב הרגולטורים מספר עם גורמי שעתוק לוקח תפקיד מיוחד במינו זה תהליך9,10,11,12. זוהו גורמי שעתוק ויסות בביטוי הגן בהקשר יכולות רבות מינים (למשל, עבור פיתוח ובידול)13,14,15, 16,17,18. שגיאות במנגנוני הבקרה מורכבים המערבים גורמי שעתוק יכול להוביל מגוון תהליכים פיפטות כולל סרטן19,20. לפיכך, זיהוי גורמי שעתוק, המטרות המתאימות שלהם עשויים להציע הרומן השדרות טיפולית21,22. כדי לחקור את שדה מסקרן זה מספר שיטות זמינים כמו שבב, ניידות electrophoretic assay shift (EMSA), מבחני נפתחים דנ א שונים כתב-מבחני8,11,12, 23 , 24.
כדי להדגים כי גורם שעתוק מסוימים אינטראקציה עם אזורים ספציפיים בגנום ויוו, השבב הוא טכניקה אידיאלית25. למטרה זו, ה-DNA, חלבונים הקשורים בתאים חיים הם קישורים צולבים באמצעות הקרנת UV או פורמלין (שבב צולבים, XChIP). שלב זה מושמט להשיג DNA יותר ושחזור חלבון כביכול יליד שבב (NChIP)26. מתחמי ה-DNA-חלבון מוטים לאחר מכן על ידי sonication לחלקים של 200-500 בסיסים (bp) immunoprecipitated תא הלבלב באמצעות של נוגדנים ספציפיים נגד גורם שעתוק עניין. שברי DNA המשויך מכן מטוהרים, המאופיינת PCR שיבוט מולקולרי, רצף. טכניקות חלופיות להשתמש מיקרו-מערכים (שבב על שבב) או רצף הדור הבא (צ’יפ-Seq) כדי לנתח את immunoprecipitated ה-DNA.
שבב הוצג לראשונה על ידי גילמור, ליס ב-1984 כאשר הם בשימוש UV אור כדי covalently קישור DNA וכרוך בכריכת חלבונים חיים חיידקים27. בעת פירוק התא, immunoprecipitation של חיידקי RNA פולימראז, הגששים ספציפי של גנים ידועים שימשו כדי למפות את התפלגות ויוו ואת צפיפות של RNA פולימראז. השיטה שימש לאחר מכן על ידי החוקרים אותו כדי לנתח את חלוקת האיקריוטים RNA פולימראז II על חום הלם חלבון גנים דרוזופילה28. וזמינותו XChIP היה מעודן יותר מאת ורשבסקי ועמיתים הנפוץ פורמלדהיד cross-linking ללמוד השיוך של היסטון H4 חום הלם חלבון גנים29,30. הגישה NChIP, אשר נושאת את היתרון של החלמה טובה יותר DNA וחלבון עקב epitopes באופן טבעי ללא פגע, לכן, להגדיר נוגדן, תוארה לראשונה על ידי Hebbes ועמיתיו בשנת 198831.
היתרון של שבב לעומת טכניקות אחרות לניתוח אינטראקציות חלבון-דנ א היא, למעשה, האינטראקציה בפועל של פקטור שעתוק ניתן ובדוקים ויוו טראקיס או מלאכותי שנוצר על-ידי אנשים רגילים או ג’לים התנאים מועסק8,11,12. על ידי שילוב שבב עם הדור הבא רצפי, מטרות מרובות ניתן לזהות בו זמנית.
מגבלות הגדולות של טכניקה זו הם שלה תחולה מוגבלת כדי מבחני בקנה מידה גדול אורגניזמים שלמים25. ניתוח דפוסי ביטוי גנים דיפרנציאלי יכול להיות גם מאתגר באמצעות טכניקות צ’יפ אם החלבונים בהתאמה באים לידי ביטוי רק ברמות נמוכות או תוך זמן קצר של windows. עוד פוטנציאל מגביל הוא הזמינות של נוגדן המתאים עבור השבב11.
פרוטוקול שבב המובאת כאן יכול להיות מועסק לצורך זיהוי ויוו של היעד גנים של פקטור שעתוק מאת PCR כמותי בזמן אמת (לרביעיית-PCR). באופן ספציפי, המטרה היא לזהות היעד הרומן גנים של NFAT2 ב CLL. שבב נבחר בגלל הפוטנציאל להדגים ישירות את הכריכה של NFAT2 אל מחוזות מקדם מטרה שונים גנים בתנאים טבעיים בתאי החולה CLL אדם.
Protocol
Representative Results
Discussion
השלבים הקריטיים של ביצוע וזמינותו שבב מוצלחת של הבחירה של נוגדן המתאים הינם אופטימיזציה של כרומטין הטיית תהליך25. הבחירה של הנוגדן αNFAT2 הוכיחה להיות מאתגרת במיוחד במהלך הפיתוח של פרוטוקול זה. אמנם ישנם מספר נוגדנים αNFAT2 זמינים מסחרית, רוב העבודות האלה בסדר גמור עבור סופג המערב…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו נתמכה על ידי DFG הענק מו 3340/1-1 ו- Krebshilfe דויטשה את הענק 111134 (שניהם הוענק M.R.M.). אנו מודים אלקה Malenke לסיוע טכני מעולה).
Materials
| 1 X PBS | Sigma Aldrich | D8537 | |
| 1.5 mL tube shaker Themomixer comfort | Eppendorf | 5355 000.011 | Can be substituted with similar instruments |
| 10X Bolt Sample Reducing Agent | Thermo Scientific | B0009 | |
| 20X Bolt MES SDS Running Buffer | Thermo Scientific | B0002 | |
| 37 % Formaldehyde p.a., ACS | Roth | 4979.1 | |
| 4X Bolt LDS Sample Buffer | Thermo Scientific | B0007 | |
| Anti-NFAT2 antibody | Alexis | 1008505 | Clone 7A6 |
| Anti-NFAT2 antibody | Cell Signaling | 8032S | Clone D15F1 |
| Anti-NFAT2 antibody ChIP Grade | Abcam | ab2796 | Clone 7A6 |
| big Centrifuge | Eppendorf | 5804R | Can be substituted with similar instruments |
| CD19-FITC mouse Anti-human | BD Biosciences | 555412 | Clone HIB19 |
| CD5-PE mouse Anti-human CD5 | BD Biosciences | 555353 | Clone UCHT2 |
| Density gradient medium Biocoll (Density 1,077 g/ml) | Merck | L 6115 | |
| DNA LoBind Tube 1.5 mL | eppendorf | 22431021 | |
| FBS superior | Merck | S0615 | |
| Flow Cytometer | BD Biosciences | FACSCalibur | Can be substituted with similar instruments |
| Halt Protease and Phosphatase Inhibitor Cocktail (100X) | Thermo Scientific | 78440 | |
| iBlot 2 Gel Transfer Device | Thermo Scientific | IB21001 | |
| iBlot 2 Transfer Stacks, nitrocellulose, regular size | Thermo Scientific | IB23001 | |
| iDeal ChIp-seq kit for Histones | Diagenode | C01010059 | |
| Ionomycin calcium salt | Sigma Aldrich | I3909 | |
| IRDye 680LT Donkey anti-Rabbit IgG (H + L), 0.5 mg | LI-COR Biosciences | 926-68023 | |
| IRDye 800CW Goat anti-Mouse IgG (H + L), 0.1 mg | LI-COR Biosciences | 925-32210 | |
| LI-COR Odyssey Infrared Imaging System | LI-COR Biosciences | B446 | |
| LightCycler 480 Multiwell Plate 96, white | Roche | 4729692001 | Can be substituted with other plates in different real-time PCR instruments |
| Lysing Solution OptiLyse B | Beckman Coulter | IM1400 | |
| M220 AFA-grade water | Covaris | 520101 | |
| M220 Focused-ultrasonicator | Covaris | 500295 | |
| Magnetic rack, DynaMag-15 Magnet | Thermo Scientific | 12301D | Can be substituted with similar instruments |
| MEM Non-Essential Amino Acids Solution 100X | Thermo Scientific | 11140050 | |
| Microscope Axiovert 25 | Zeiss | 451200 | Can be substituted with similar instruments |
| microTUBE AFA Fiber Pre-Slit Snap-Cap 6x16mm | Covaris | 520045 | |
| Neubauer improved counting chamber | Karl Hecht GmbH & Co KG | 40442012 | Can be substituted with similar instruments |
| NH4 Heparin Monovette | Sarstedt | 02.1064 | |
| Nuclease-free water | Promega | P1193 | |
| NuPAGE 4-12% Bis-Tris Protein Gels, 1.0 mm, 15-well | Thermo Scientific | NP0323BOX | |
| Odyssey® Blocking Buffer (TBS) 500 mL | LI-COR Biosciences | 927-50000 | |
| Penicillin/Streptomycin 100X | Merck | A2213 | |
| PerfeCTa SYBR Green FastMix | Quanta Bio | 95072-012 | |
| PMA | Sigma Aldrich | P1585 | |
| Primer CD40L promotor region forward | Sigma Aldrich | 5’-ACTCGGTGTTAGCCAGG-3’ | |
| Primer CD40L promotor region reverse | Sigma Aldrich | 5’-GGGCTCTTGGGTGCTATTGT -3’ | |
| Primer IL-2 promotor region forward | Sigma Aldrich | 5’-TCCAAAGAGTCATCAGAAGAG-3’ | |
| Primer IL-2 promotor region reverse | Sigma Aldrich | 5’-GGCAGGAGTTGAGGTTACTGT-3’ | |
| Primer LCK promotor region forward | Sigma Aldrich | 5’-CAGGCAAAACAGGCACACAT-3’ | |
| Primer LCK promotor region reverse | Sigma Aldrich | 5’-CCTCCAGTGACTCTGTTGGC-3’ | |
| Rabbit mAb IgG XP Isotype Control | Cell Signaling | # 3900S | Clone DA1E |
| Real-time PCR instrument | Roche | LightCycler 480 | Can be substituted with similar instruments |
| Roller mixers | Phoenix Instrument | RS-TR 5 | |
| RPMI 1640 Medium, GlutaMAX Supplement | Thermo Scientific | 61870010 | |
| Safety-Multifly-needle 21G | Sarstedt | 851638235 | |
| SeeBlue Plus2 Pre-stained Protein Standard | Thermo Scientific | LC5925 | |
| Shaker Duomax 1030 | Heidolph Instruments | 543-32205-00 | Can be substituted with similar instruments |
| small Centrifuge | Thermo Scientific | Heraeus Fresco 17 | Can be substituted with similar instruments |
| Sodium Pyruvate | Thermo Scientific | 11360070 | |
| ß-Mercaptoethanol | Thermo Scientific | 21985023 | |
| Tris Buffered Saline (TBS-10X) | Cell Signaling | #12498 | |
| Trypan Blue solution | Sigma Aldrich | 93595-50ML |
Referenzen
- Byrd, J. C., Jones, J. J., Woyach, J. A., Johnson, A. J., Flynn, J. M. Entering the Era of Targeted Therapy for Chronic Lymphocytic Leukemia: Impact on the Practicing Clinician. Journal of Clinical Oncology. 32 (27), 3039-3047 (2014).
- Woyach, J. A. Survival of the weak (signalers): anergy in CLL. Blood. 121 (19), 3781-3783 (2013).
- Hallek, M., et al. Guidelines for diagnosis, indications for treatment, response assessment and supportive management of chronic lymphocytic. Blood. , (2018).
- Hogan, P. G., Chen, L., Nardone, J., Rao, A. Transcriptional regulation by calcium, calcineurin, and NFAT. Genes and Development. 17 (18), 2205-2232 (2003).
- Macian, F. NFAT proteins: key regulators of T-cell development and function. Nature Reviews Immunology. 5 (6), 472-484 (2005).
- Muller, M. R., Rao, A. NFAT, immunity and cancer: a transcription factor comes of age. Nature Reviews Immunology. 10 (9), 645-656 (2010).
- Marklin, M., et al. NFAT2 is a critical regulator of the anergic phenotype in chronic lymphocytic leukaemia. Nature Communications. 8 (1), 755 (2017).
- Geertz, M., Maerkl, S. J. Experimental strategies for studying transcription factor-DNA binding specificities. Briefings in Functional Genomics. 9 (5-6), 362-373 (2010).
- Slattery, M., et al. Absence of a simple code: how transcription factors read the genome. Trends in Biochemical Sciences. 39 (9), 381-399 (2014).
- Cumbo, F., Vergni, D., Santoni, D. Investigating transcription factor synergism in humans. DNA Research. , (2017).
- Gade, P., Kalvakolanu, D. V. Chromatin Immunoprecipitation Assay as a Tool for Analyzing Transcription Factor Activity. Methods in molecular biology. 809, 85-104 (2012).
- Mundade, R., Ozer, H. G., Wei, H., Prabhu, L., Lu, T. Role of ChIP-seq in the discovery of transcription factor binding sites, differential gene regulation mechanism, epigenetic marks and beyond. Cell Cycle. 13 (18), 2847-2852 (2014).
- Flores, E., Picossi, S., Valladares, A., Herrero, A. Transcriptional regulation of development in heterocyst-forming cyanobacteria. Biochimica et Biophysica Acta. , (2018).
- Callens, C., Tucker, M. R., Zhang, D., Wilson, Z. A. Dissecting the role of MADS-box genes in monocot floral development and diversity. Journal of Experimental Botany. 69 (10), 2435-2459 (2018).
- Shen, Q., Toulabi, L. B., Shi, H., Nicklow, E. E., Liu, J. The forkhead transcription factor UNC-130/FOXD integrates both BMP and Notch signaling to regulate dorsoventral patterning of the C. elegans postembryonic mesoderm. Entwicklungsbiologie. 433 (1), 75-83 (2018).
- Tang, X., Zhao, Y., Buchon, N., Engstrom, Y. The POU/Oct Transcription Factor Nubbin Controls the Balance of Intestinal Stem Cell Maintenance and Differentiation by Isoform-Specific Regulation. Stem Cell Reports. , (2018).
- Bertacchi, M., Parisot, J., Studer, M. The pleiotropic transcriptional regulator coup-tfi plays multiple roles in neural development and disease. Brain Research. , (2018).
- Aronson, B. E., Stapleton, K. A., Krasinski, S. D. Role of GATA factors in development, differentiation, and homeostasis of the small intestinal epithelium. American Journal of Physiology: Gastrointestinal and Liver Physiology. 306 (6), G474-G490 (2014).
- Fernandez, L. P., Lopez-Marquez, A., Santisteban, P. Thyroid transcription factors in development, differentiation and disease. Nature Reviews: Endocrinology. 11 (1), 29-42 (2015).
- Jiang, S., et al. Novel role of Forkhead box O 4 transcription factor in cancer: bringing out the good or the bad. Seminars in Cancer Biology. , (2018).
- Daniel, P. M., et al. PI3K Activation in Neural Stem Cells Drives Tumorigenesis which can be Ameliorated by Targeting the cAMP Response Element Binding (CREB) Protein. Neuro-Oncology. , (2018).
- Chen, W. T., Chen, Y. K., Lin, S. S., Hsu, F. T. Hyperforin Suppresses Tumor Growth and NF-kappaB-mediated Anti-apoptotic and Invasive Potential of Non-small Cell Lung Cancer. Anticancer Research. 38 (4), 2161-2167 (2018).
- Ausubel, F. M. . Current protocols in molecular biology. , (1994).
- Garner, M. M., Revzin, A. A gel electrophoresis method for quantifying the binding of proteins to specific DNA regions: application to components of the Escherichia coli lactose operon regulatory system. Nucleic Acids Research. 9 (13), 3047-3060 (1981).
- Fujita, T., Fujii, H. Biochemical Analysis of Genome Functions Using Locus-Specific Chromatin Immunoprecipitation Technologies. Gene Regulation and Systems Biology. 10 (Suppl 1), 1-9 (2016).
- O’Neill, L. P., Turner, B. M. Immunoprecipitation of native chromatin: NChIP. Methods. 31 (1), 76-82 (2003).
- Gilmour, D. S., Lis, J. T. Detecting protein-DNA interactions in vivo: distribution of RNA polymerase on specific bacterial genes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 81 (14), 4275-4279 (1984).
- Gilmour, D. S., Lis, J. T. In vivo interactions of RNA polymerase II with genes of Drosophila melanogaster. Molecular and Cellular Biology. 5 (8), 2009-2018 (1985).
- Solomon, M. J., Larsen, P. L., Varshavsky, A. Mapping protein-DNA interactions in vivo with formaldehyde: evidence that histone H4 is retained on a highly transcribed gene. Cell. 53 (6), 937-947 (1988).
- Varshavsky, A. Discovery of cellular regulation by protein degradation. Journal of Biological Chemistry. 283 (50), 34469-34489 (2008).
- Hebbes, T. R., Thorne, A. W., Crane-Robinson, C. A direct link between core histone acetylation and transcriptionally active chromatin. EMBO Journal. 7 (5), 1395-1402 (1988).
- Decker, E. L., Skerka, C., Zipfel, P. F. The early growth response protein (EGR-1) regulates interleukin-2 transcription by synergistic interaction with the nuclear factor of activated T cells. Journal of Biological Chemistry. 273 (41), 26923-26930 (1998).
- Grammer, A. C., et al. The CD40 ligand expressed by human B cells costimulates B cell responses. Journal of Immunology. 154 (10), 4996-5010 (1995).
- Pham, L. V., Tamayo, A. T., Yoshimura, L. C., Lin-Lee, Y. C., Ford, R. J. Constitutive NF-kappaB and NFAT activation in aggressive B-cell lymphomas synergistically activates the CD154 gene and maintains lymphoma cell survival. Blood. 106 (12), 3940-3947 (2005).
- Zhou, Z. H., et al. The acid-sensing ion channel, ASIC2, promotes invasion and metastasis of colorectal cancer under acidosis by activating the calcineurin/NFAT1 axis. Journal of Experimental and Clinical Cancer Research. 36 (1), 130 (2017).
- Estrada-Aviles, R., Rodriguez, G., Zarain-Herzberg, A. The cardiac calsequestrin gene transcription is modulated at the promoter by NFAT and MEF-2 transcription factors. PloS One. 12 (9), e0184724 (2017).
- Kadziolka, B., Lesniak, W., Filipek, A. Regulation of CacyBP/SIP expression by NFAT1 transcription factor. Immunobiology. 222 (8-9), 872-877 (2017).
- Lieb, J. D., Liu, X., Botstein, D., Brown, P. O. Promoter-specific binding of Rap1 revealed by genome-wide maps of protein-DNA association. Nature Genetics. 28 (4), 327-334 (2001).
- Ren, B., et al. Genome-wide location and function of DNA binding proteins. Science. 290 (5500), 2306-2309 (2000).
- Iyer, V. R., et al. Genomic binding sites of the yeast cell-cycle transcription factors SBF and MBF. Nature. 409 (6819), 533-538 (2001).
- Johnson, D. S., Mortazavi, A., Myers, R. M., Wold, B. Genome-wide mapping of in vivo protein-DNA interactions. Science. 316 (5830), 1497-1502 (2007).
- Robertson, G., et al. Genome-wide profiles of STAT1 DNA association using chromatin immunoprecipitation and massively parallel sequencing. Nature Methods. 4 (8), 651-657 (2007).
- Schmid, C. D., Bucher, P. ChIP-Seq data reveal nucleosome architecture of human promoters. Cell. 131 (5), 831-832 (2007).
